[发明专利]一种采用LC-MS检测低分子肝素中寡糖含量的方法及应用

说明书

本发明属于药物化学分析技术领域，具体涉及一种采用LC‑MS检测低分子肝素中寡糖含量的方法及应用。该方法包括：(1)使用液相色谱方法分离低分子肝素进样样品；(2)进入质谱检测器进行检测；(3)自动分析质谱数据库，通过质荷比和保留时间对分析组分进行匹配归属，对归属后的寡糖响应值进行归一化处理，得到各寡糖的百分比含量。该方法可以在100min内将寡糖分离出来，分离块，且分离的寡糖类型多；并且对二糖标准品的质量数的实际测量值与理论值的相对偏差在5.0ppm以内，代表性4糖(dp4)、6糖(dp6)、8糖(dp8)和10糖(dp10)的质量数的实际测量值与理论值的相对偏差在5.0ppm以内。

技术领域

本发明属于药物化学分析技术领域，具体涉及一种采用LC-MS检测低分子肝素中寡糖含量的方法及应用。

背景技术

低分子肝素(low molecular weight heparin，LMWH)系由未分级肝素(unfractioned heparin，UFH)经不同降解工艺制得，其单糖成分、取代方式和寡糖序列结构特征与肝素相近。相对于UFH，LMWH在抗血栓形成活性、生物利用度和出血不良反应等方面具有明显的优势。目前市场上使用的主要是达肝素钠、依诺肝素钠和那曲肝素钙，为抗凝血、抗血栓形成药。结构表证是药物化学领域中重要的环节，在构效关系研究和药物质量控制中起着重要作用。然而肝素的二糖重复单元在糖醛酸残基上可能发生2-O-硫酸基取代，在葡萄糖胺残基上可能发生N-乙酰基取代、N-硫酸基取代、6-O-硫酸基取代和3-O-硫酸基取代。肝素的降解过程也会使糖链末端发生改变，因此低分子肝素是高度异质性的混合物，具有复杂的分子结构，其寡糖序列的鉴定是低分子肝素类药物研究的重难。

现有专利CN201110241617一种用测依诺肝素钠二糖的方法，肝素酶I∶酶II∶酶III＝8∶1∶2的混合酶溶液，室温下酶解48小时，取降解产物做SAX-HPLC分析得到各种二糖，与市售的二糖标准品比对保留时间进行定性，再通过各二糖标准品对检测器响应值和物质量的标准曲线进行定量。该专利方法耗时长，市售二糖标准品价格昂贵且品类不全，无法对降解得到的所有二糖、四糖进行定性及定量分析；而且通过酶I、II、III酶解后，葡萄糖醛酸(GlcA)及艾杜糖醛酸(IDoA)脱水后形成结构相同的脱水糖醛酸，从而失去了肝素中葡萄糖醛酸(GlcA)及艾杜糖醛酸(IdoA)的含量与结构信息。

现有专利CN113393904A公开了一种计算机软件辅助用于低分子肝素类药物的糖链序列测定的低分子肝素糖链序列检测方法、系统及测序试剂盒。该专利对低分子肝素寡糖混合物样品进行完全酶解和亚硝酸降解，分别获得酶解的8中基本组成单元数组和3-O-硫酸数组及内醚数组、亚硝酸降解数组，根据基本组成单元数组及亚硝酸降解数组通过对不同二糖的IdoA/GlcA进行计算获得二糖异构单元数组；根据寡糖聚合度、二糖异构单元数组、3-O-硫酸数组及内醚数组构建序列数据库，根据输入的限定条件信息通过序列数据库进行筛选输出结果文件。但该法酶解耗时长(72h)，亚硝酸降解操作复杂，构建序列数据库复杂，不具有简单操作性。

因此，开发一种耗时短，操作简答，检测范围全的低分子肝素中寡糖含量中的方法。

发明内容

针对以上问题，本发明目的在于提供一种分离低分子肝素中寡糖及检测寡糖含量的方法，该方法是利用液相色谱对低分子肝素中的寡糖进行分离，然后通过质谱检测得到检测数据库，通过分析软件分析质谱数据库，通过质荷比和保留时间对分析组分进行匹配归属，对归属后的寡糖响应值进行归一化处理，得到各寡糖的百分比含量。

为了达到上述目的，本发明可以采用以下技术方案：