[发明专利]一种融合标签的固定化蔗糖异构酶及其生产和应用

权利要求书

1.一种融合标签的固定化蔗糖异构酶的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

将碳水化合物结构域CBM17与来源于Klebsiella sp.LX3的蔗糖异构酶Pal I融合，以获得融合基因CBM17-PalI，通过CBM17与微晶纤维素接触结合，将融合基因CBM17-PalI固定于微晶纤维素表面，制备固定化蔗糖异构酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过CBM17与微晶纤维素接触结合，将融合基因CBM-PalI固定于微晶纤维素表面过程包括以下步骤：

(1)称取10mg微晶纤维素Avicel PH101(Fluka)置于离心管中，加入0.5-1.5mL(优选1-1.2mL)的1-6mg/mL(优选5-6mL)融合标签的蔗糖异构酶(融合基因CBM17-PalI)酶液；

(2)在0-50℃(优选30-35℃)，结合20-120min(优选80-90min)，5000-7000r/min(优选6000-6500r/min)离心3-7min(优选5-6min)，去除上清，将沉淀用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液清洗，剩余沉淀即得固定化酶。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)称取10mg Avicel PH101置于离心管中，加入1mL的6mg/mL融合标签的蔗糖异构酶酶液；

(2)在30℃，结合80min，6000r/min离心5min，倒出上清，将沉淀用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液清洗，剩余沉淀即得固定化酶。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，融合基因CBM-PalI的获取过程包括以下步骤：

(一)融合标签的蔗糖异构酶的表达菌株的构建，包括以下步骤：

(1)以pHT43-PalI为模板，设计P1-F/R为引物，进行蔗糖异构酶编码基因PalIRF-clone第一轮产物的扩增，将扩增产物进行胶回收，得到PalI编码基因；

(2)以(1)中胶回收产物为引物进行RF-clone，将PalI与载体模板中GFP进行替换，替换至pET28-CBM17-GFP载体模板上CBM17的下游，并通过5×Gly连接子将PalI与CBM17连接，PalI末端含6×His标签；

(3)将(2)中得到的RF-clone产物用DpnI35-40℃(优选36-38℃)消化8-16(优选11-13h)h，电击转化至克隆菌E.coli DH10B感受态细胞中；涂布于含Kan质量浓度为20-40μg/mL(优选25-30μg/mL)的LB固体培养基，在35-40℃(优选36-38℃)培养12～16h(优选13-14h)直至出现单菌落；

(4)利用大肠杆菌通用引物T7-F/R对平板上出现的单菌落，进行菌落PCR验证；对鉴定正确的转化子进行LB液体培养，提取质粒，测序；

(5)将测序正确的转化子的质粒热激转化入表达宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，最终得到融合标签的蔗糖异构酶的表达菌株，命名为pET28-CBM17-PalI；

(二)融合基因CBM17-PalI蔗糖异构酶的生产：

以步骤(一)获得的pET28-CBM17-PalI为生产菌株，在种子LB培养基中30-40℃(优选35-37℃)、180-220r/min(优选200-210r/min)，振荡培养至OD₆₀₀为2.0，将种子液按1:50体积比例接种至LLB液体培养基中，30-40℃(优选36-38℃)、180-220r/min(优选200-210r/min)振荡培养至OD₆₀₀为0.6时加入终浓度为0.4-0.6mmol/L(优选0.5-0.55mmol/L)的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，15-20℃(优选16-17℃)、180-220r/min(优选200-210r/min)振荡培养16～20h(优选17-18h)，诱导蔗糖异构酶的表达，然后在2-6℃(优选3.5-4.5℃)、6000-10000g(优选8000-9000g)条件下离心3-7min(优选5-6min)收集菌体，分别利用去离子水和0.05-0.2mol/L(优选0.1-0.15mol/L)、pH6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液清洗菌体，然后用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液重悬菌体，使用超声破碎仪将其在550W(工作5s，间隔2s)条件下超声破碎10-30min(优选15-20min)；2-6℃(优选3.5-4.5℃)、8000-10000g(优选9000-10000g)条件下离心10-30min(优选20-25min)收集上清，即可得到蔗糖异构酶粗酶液。