[发明专利]一种融合标签的固定化蔗糖异构酶及其生产和应用

说明书

本发明公开了一种蔗糖异构酶的固定化方法，属于蔗糖异构酶发酵方法技术领域，成功制备了一种环境友好、经济可行、稳定性高的固定化蔗糖异构酶，具体方法包括以下步骤：通过无限制克隆法构建融合CBM17标签的PalI表达载体，基于CBM17与微晶纤维素自发结合的特性，制备该酶的固定化酶。固定化蔗糖异构酶的最适温度及pH分别为45℃，pH6.0，而其温度稳定性及pH稳定性较游离酶均有提高，最高酶活力为11.04±0.02U/mg微晶纤维素(Avicel PH101)；固定化酶与底物蔗糖亲和力增强，Km为79.94±9.56mmol/L；该固定化酶具有良好的储存稳定性，在4℃下储存至49d时，酶活力仍有60％。本发明的这种固定化策略为蔗糖异构酶在工业中的应用提供了一种新的思路。

技术领域

本发明涉及一种蔗糖异构酶的固定化方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

异麦芽酮糖又称帕拉金糖，是由α-D-吡喃葡糖和α-1,6-D-果糖通过α-1,6糖苷键连接而成的一种功能性低聚糖，微量存在于甘蔗、甜菜和蜂蜜中。异麦芽酮糖的生产过程中主要使用酶异构法，酶异构法是利用蔗糖异构酶(SIase,EC5.4.99.11)转化蔗糖生成异麦芽酮糖，此方法对环境友好且速率明显高于其他方法。但是此方法存在酶的分离纯化成本高、稳定性较差、无法回收再利用等问题。

因此，对蔗糖异构酶进行不同形式的固定化以提高其稳定性，可以有效降低其生产和使用成本，具有广泛的应用前景，但是普遍还是存在一些问题例如转化效率不高以及材料成本过高，难以大规模工业生产等。因此，对蔗糖异构酶进行不同形式的固定化以提高其稳定性，降低其分离成本的同时提高其回收利用率，可以有效降低其生产和使用成本，具有广泛的应用前景。目前，针对蔗糖异构酶的固定化研究主要集中在两个方面，一方面是利用细胞表面展示技术将该酶固定化于细胞表面，另一方面是利用化学固定法将该酶固定于化学载体上。利用细胞表面展示技术的蔗糖异构酶的固定化普遍存在因展示效率不高而导致的转化效率不高；而化学载体又存在材料有毒，无法应用于食品行业，材料成本过高等问题。因此，寻求一种环保无毒、成本经济、操作简单、酶活力回收率高且稳定性良好的酶固定化方法仍然是目前蔗糖异构酶固定化研究中亟待解决的问题。针对上述异麦芽酮糖生产中存在的问题，本发明通过将碳水化合物结构域CBM17(其中CBM17的来源于Clostridiumjosui(约氏梭菌)菌种，GenBank:AGI56000.1，对编码CBM17所有基因进行了密码子优化，由上海生工生物技术有限公司合成，具体参考此篇论文，X.Guo,F.Yang,H.Liu,etal.,Prediction of Cellulose Crystallinity in Liquid Phase Using CBM-GFP Probe.[J].Macromolecular Research.2019.27{4}:377-385。其中pET28a-GFP购自BioVectorNTCC质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心.)与来源于Klebsiella sp.LX3的蔗糖异构酶PalI(其中PalI来源于Klebsiella sp.LX3(克雷伯氏菌.LX3)菌种，GenBank:KJ452353.1，具体参考此篇论文，王兵兵.对来源于Klebsiella sp.LX3的蔗糖异构酶PalⅠ的定点突变及枯草芽孢杆菌表达产物发酵转化分析[D].大连工业大学,2019.DOI:10.26992/d.cnki.gdlqc.2019.000141.其中pHT43载体购买自武汉淼灵生物科技有限公司。)融合，以获得融合基因CBM17-PalI，基于CBM17与微晶纤维素自发结合的特性，通过一步纯化-固定化固定于微晶纤维素表面，制备固定化蔗糖异构酶，这种酶固定化策略安全无毒，并且酶与载体结合是自发的，无需使用其他的化学试剂，可实现酶的一步纯化-固定化，避免了纯化步骤，可回收利用，该方法为蔗糖异构酶在工业中的应用提供了一种无毒、廉价的固定化策略。

发明内容

本发明提供了一种固定化蔗糖异构酶的方法。

为此，本发明首先构建了一株融合标签的蔗糖异构酶的表达菌株的构建，其特征在于，包括以下步骤：