[发明专利]用于成团泛菌胞内游离复制的质粒及其转化方法

权利要求书

1.一种用于成团泛菌胞内游离复制的质粒，其特征在于，包含大肠杆菌复制起始区。

2.根据权利要求1所述的一种用于成团泛菌胞内游离复制的质粒，其特征在于，所述质粒为pMV306或pMV26B。

3.根据权利要求1所述的一种用于成团泛菌胞内游离复制的质粒，其特征在于，所述质粒为pEA-101，其构建过程如下：使用引物306_F:

GCCAGCTAGCAACAAAGCGAC和306_R:TTTAGCTAGCTGATCACCGC GGCCATGATG反向PCR扩增获得去除了整合酶基因的pMV306质粒，使用NheⅠ酶切后连接转化大肠杆菌top10，获得重组质粒pEA-101。

4.根据权利要求3所述的一种用于成团泛菌胞内游离复制的质粒，其特征在于，所述质粒为pEA102，其构建过程如下：使用XbaⅠ酶切pHY773质粒，胶回收获得阿泊拉霉素抗性基因后与使用NheⅠ酶切后纯化的pEA101质粒连接，转化大肠杆菌top10，获得重组质粒pEA-102。

5.根据权利要求3所述的一种用于成团泛菌胞内游离复制的质粒，其特征在于，所述质粒为pEA103，其构建过程如下：使用XbaⅠ酶切pHY778质粒，胶回收获得壮观霉素抗性基因后与使用NheⅠ酶切后纯化的pEA101质粒连接，转化大肠杆菌top10，获得重组质粒pEA-103。

6.根据权利要求3所述的一种用于成团泛菌胞内游离复制的质粒，其特征在于，所述质粒为pEA104，其构建过程如下：使用引物Cat_F:

TTTAGCTAGCTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCA和Cat_R:

TTTAGCTAGCCGCGCAGACCAAAACGATCTC，以pSU2718质粒为模板，PCR扩增获得cat基因；NheⅠ酶切胶回收纯化的cat基因后与使用NheⅠ酶切后纯化的pEA101质粒连接，转化大肠杆菌top10，获得重组质粒pEA-104。

7.权利要求1-6任一所述质粒的转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)从LB固体培养基平板挑取成团泛菌单菌落，将其培养于装有的LB液体培养基的玻璃管中，放入恒温振动器中设置参数为30℃、200r/min、振荡培养过夜；

(2)抽取菌液，加入Lemco-Tw液体培养基中30℃、200r/min进行扩培；当OD600值为0.5时，将培养好的锥形瓶置于冰上放置20min；

(3)4℃、5500r/min离心5-10min收集菌体，加入预冷的10％甘油溶液充分洗涤菌体；

(4)重复步骤(3)若干次，直至将培养基中的离子充分去除；

(5)用10％甘油溶液重悬菌体，在菌液中加入质粒，混匀后于冰上静置5min；

(6)将菌体和质粒混合物吸入预冷的电击杯中，设置BTX ECM830电转条件为电压2500V，波长为100μS，电击次数为12次，电击间隔2S；

(7)电击结束后迅速将电击杯中的菌液轻柔吸取后转入加有10mL LB液体培养基的50mL离心管中，30℃，200r/min培养4h；

(8)将步骤7所述培养物涂布相应抗生素固体平板，30℃培养48-72h后获得单菌落。

8.根据权利要求7所述的的转化方法，其特征在于，Lemco-Tw液体培养基中包含：胰蛋白胨5.0g/L，牛肉浸膏5.0g/L，氯化钠5.0g/L，10％(w/v)吐温-80 5.0mL。