[发明专利]用于成团泛菌胞内游离复制的质粒及其转化方法

说明书

本发明提供了可用于成团泛菌胞内游离复制的质粒和转化方法，可用于在成团泛菌内进行内源和异源基因的表达。如果进一步增加可用基因元器件，这些质粒在成团泛菌的基因编辑、底盘细胞和细胞工厂改造等方面都具有潜在的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于成团泛菌胞内游离复制的质粒和转化方法。

背景技术

成团泛菌(Pantoea agglomerans)是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)泛菌属(Pantoea)成员之一。泛菌属细菌具有高度多样化和多变的特征，它们既是植物，动物，人类的机会病原体，同时也可产生herbicolin、pantocins、microcin、agglomerins、andrimid等多种活性成分，对宿主起到保护作用。除CN115820676A提供了一种基于成团泛菌的基因敲除方案，至今尚未见其他基于成团泛菌进行质粒适配和DNA操作相关的研究报道。

发明内容

本发明提供了可用于成团泛菌胞内游离复制的质粒和转化方法，可用于在成团泛菌内进行内源和异源基因的表达。如果进一步增加可用基因元器件，这些质粒在成团泛菌的基因编辑、底盘细胞和细胞工厂改造等方面都具有潜在的应用价值。

由于成团泛菌在分类上曾经被命名为Bacillus agglomerans、Erwiniaherbicola和Enterobacter agglomerans，本发明最开始尝试选用分枝杆菌整合质粒pMV306和基于大肠杆菌和分枝杆菌游离穿梭质粒pMV261改进的pMV26B(分枝杆菌质粒复制区替换为棒杆菌pCG100复制区)，使用BTX ECM830对成团泛菌进行电穿孔转化测试。

pMV26B质粒的构建过程如下：

(1)以pMV261质粒为模板，使用引物(26_F:TTTACATATGCAACTGGCAGCCGACTGTCC，26_R:TTTACATATGACGA CCAGCAGGTTTGCCAG)反向PCR去除分枝杆菌的复制起始区oriM，获得去除起始区的质粒片段。

(2)依据pCG100的质粒复制起始区序列，请通用生物系统(安徽)有限公司合成后克隆于pUC57质粒的EcoRⅤ位点，该质粒命名为pUC57-oriP。

(3)NdeⅠ酶切pUC57-oriP，获得pCG100的质粒复制起始区片段，与同样使用NdeⅠ酶切的去除oriM的pMV261质粒骨架连接，获得重组质粒pMV26B。

在电压为2500V，波长为100μS，电击次数为12次，电击间隔2S的电转条件下，成团泛菌可以分别成功获得带有pMV306和pMV26B转化子。使用大肠杆菌质粒抽提方法抽提成团泛菌转化子的质粒后转化大肠杆菌top10可获得带有相应质粒的大肠杆菌；使用验证引物(kan_yzF:TTCAACGGGA AACGTCTTGCTC和kan_yzR:CCTGGTATCG GTCTGCGATTC)，以成团泛菌总染色体为模板PCR可以获得pMV306和pMV26B质粒上的抗性基因片段，证明pMV306和pMV26B质粒均可在成团泛菌中游离复制，暗示这两个质粒的大肠杆菌复制起始区可在成团泛菌中成功复制。

进一步地，本实验以pMV306为基础，构建可在成团泛菌中复制的最小质粒pEA-101，构建过程如下：

使用引物306_F:GCCAGCTAGCAACAAAGCGAC和306_R:TTTAGCTAGCTGATCACCGCGGCCATGATG反向PCR扩增获得去除了整合酶基因的pMV306质粒，使用NheⅠ酶切后连接转化大肠杆菌top10，获得重组质粒pEA-101。