[发明专利]一种基于甲病毒的嵌合病毒样颗粒的制备体系

说明书

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种基于甲病毒的嵌合病毒样颗粒的制备体系。该技术通过将辛德比斯病毒(Sindbis virus；SIN)的包装信号(Packaging Signal；PS)和3’端UTR序列插入塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus；SFV)表达载体，同时利用辛德比斯病毒结构基因构建了两个辅助载体，建立了嵌合SFV/SIN病毒样颗粒(VLPs)的包装系统。利用该技术制备的嵌合病毒样颗粒在疫苗研发、基因治疗等领域具备广泛的前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及了一种基于甲病毒的嵌合病毒样颗粒的制备体系。

背景技术

甲病毒属于披膜病毒科(Togaviridae)，甲病毒属(Alphavirus)。甲病毒包括近30个成员，其中最具代表性研究最深入的病毒是塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus，SFV)、辛德比斯病毒(Sindbis virus，SIN)和委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equineencephalitis virus，VEE)。

甲病毒基因组由11-12kb单股正链RNA组成，全基因组主要包括两个开放阅读框(Open reading frames，ORF)。位于基因组5’端的ORF，编码非结构蛋白(Non structuralproteins1-4，NSP1-4)，又被称为病毒复制酶，由基因组RNA直接翻译产生，NSP对病毒负链RNA、新生正链RNA亚基因组RNA的合成有重要作用。病毒结构蛋白基因(Structuralproteins，SP)位于基因组3’端的ORF，包括衣壳蛋白(C)和包膜糖蛋白(E3、E2、6K和E1)两部分。由于负链RNA和亚基因组RNA都缺少特殊的包装信号序列，因此都不能被包装进病毒颗粒。衣壳蛋白特异性识别正链RNA上的包装信号进而形成病毒的核衣壳，然后与细胞质膜上的包膜糖蛋白相互作用，出芽形成病毒颗粒。

甲病毒基因组还有含有亚基因组(26S)启动子元件，该元件被病毒复制酶识别后，启动亚基因组mRNA合成病毒结构蛋白。另外，病毒基因组和亚基因组序列的5’端和3’端还分别有非编码区域(Untranslated region，UTR)、0型cap以及polyA元件，它们的作用主要是稳定RNA结构，控制病毒的复制和翻译效率。

通常甲病毒复制子载体的相对分子量都较大，而分子量过大则会影响细胞转染效率，进而可能影响动物免疫效果。将甲病毒复制子载体包装成病毒样颗粒，则可以显著提高其转染效率和稳定性，从而提高免疫效力。与复制子DNA和RNA载体疫苗相比，病毒样颗粒(Viruslike particles，VLPs)疫苗具有非常广泛的宿主趋向性，可发挥病毒颗粒本身的免疫学特性，综合免疫效果较好。此外，在感染后期VLPs可诱导感染细胞凋亡，消除了与宿主基因组整合风险。

对于非繁殖性的载体来说，表达载体的包装需要辅助载体反式提供结构蛋白，辅助载体序列来源于甲病毒基因组，其中绝大部分复制酶序列被删除，但仍然保留了5’和3’端的非翻译区、亚基因组启动子和编码结构蛋白的开放阅读框。表达载体则包含病毒的全部非结构基因，负责表达病毒复制酶，其结构基因被删除或被外源目的基因所替代，辅助载体则负责表达病毒的结构蛋白。根据辅助载体的数量可以将包装系统分为两大类。单辅助载体系统，此系统利用单一辅助载体来表达病毒结构蛋白，通常能产生高滴度的病毒颗粒，但也会相对高频率地产生野生型病毒。在双辅助载体系统中，病毒颗粒的制备需要表达载体和两种辅助载体共同转染细胞，在该系统中，野生型病毒的产生需要两个独立的重组事件同时发生，因此产生致病性病毒颗粒的概率极低，其生物安全性得到显著提高。在表达载体和辅助载体共同转染的细胞内，复制酶不仅能够扩增表达载体上的外源基因，并且能够识别存在于辅助载体负链RNA上的亚基因组启动子，合成亚基因组mRNA，从而能够高效表达病毒结构蛋白。结构蛋白能把表达载体RNA特异性地包裹进病毒颗粒中，辅助载体RNA由于缺少位于非结构基因内的包装信号序列，因此它们通常不被包装。生成病毒颗粒虽然能感染细胞，但它们不具有病毒全长基因组，由此丧失了繁殖能力，以这种方式产生的病毒颗粒为“复制缺陷型颗粒”，又称病毒样颗粒(VLPs)。