[发明专利]一种永生化绵羊皮肤成纤维细胞系及其培养方法与应用

说明书

本发明公开了一种绵羊皮肤成纤维细胞系及其培养方法与应用。该细胞系名称为LSF‑2，保藏编号为：CGMCC NO.23100。该细胞系第50代的细胞仍保持原代细胞的形态特征，没有染色体变异。该细胞系对山羊痘病毒高度易感，其培养的山羊痘病毒比用2月龄原代羊睾丸细胞毒价至少高1.5个滴度，并且具有低血清培养、增殖速度快、易于放大、病变快、效价高的特点。用该细胞系进行山羊痘疫苗的生产实现了山羊痘病毒的传代细胞培养工艺，用低血清培养大大降低了生产成本，保证了批间稳定性，对疫苗产业化生产具有重要意义。

技术领域

本发明涉及一种自发永生化的绵羊皮肤成纤维细胞系及其培养方式与应用，属于生物技术领域。

背景技术

山羊痘(Goatpox，GP)是由山羊痘病毒(Goatpox virus，GPV)引起的一种严重危害山羊的一种急性、高度接触性传染病，该病毒在自然条件下一般只感染山羊。目前我国主要采用山羊痘活疫苗(AV41株)来预防该病，同时该疫苗对绵羊痘、牛结节性皮肤病也具有很好的保护效果。山羊痘病毒主要感染羊的原代细胞，如羊睾丸细胞、羊肾细胞、羊鼻甲粘膜细胞、羊口腔粘膜细胞、羊皮肤细胞等。对个别传代细胞如VERO细胞也有一定的感染性，但是山羊痘病毒在这种细胞上不能连续传代，即感染VERO后收获的病毒失去了再次感染能力，无法继续作为种毒进行使用。

目前山羊痘活疫苗主要采用2-3月龄羊去势的羊睾丸细胞进行生产，该生产工艺需采集大量的羊睾丸，制备羊原代睾丸细胞进行抗原生产。由于原代细胞制备工艺繁琐，一次性大量制备易污染，此外，多个羊的睾丸细胞混合后进行疫苗种毒和抗原制备也容易引发外源病毒污染，造成疫苗批次间不稳定，质量可控性较差。另外，羊的配种、繁殖具有明显的季节性，特别是在羊养殖不发达的地区很难在一个时间点收集大量的睾丸进行疫苗生产，使得疫苗的产能受时间和地域限制。目前国内外尚没有可用于山羊痘病毒疫苗抗原产业化生产的传代细胞系，为了克服现有技术的不足，寻找到一株适合山羊痘病毒疫苗抗原生产的传代细胞系将为山羊痘、绵羊痘、牛结节性皮肤病等疾病的防控带来积极的影响。

发明内容

本发明的目的在于提供一株适合山羊痘病毒疫苗抗原生产的传代细胞系，为山羊痘、绵羊痘、牛结节性皮肤病等疾病的防控带来积极的影响。该细胞系对山羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒高度易感，采用低浓度的国产新生牛血清培养，具有培养成本低、增殖速度快、易于放大、病变快、效价高的特点。用该细胞系进行山羊痘疫苗的生产实现了山羊痘病毒的传代细胞培养工艺，无需采集羊睾丸组织，操作简单，大大减少了羊源外源病毒污染风险，同时提高了生产效率和批次间稳定性，易于实现产业化，利用该工艺进行疫苗生产大大简化了山羊痘疫苗抗原的生产工艺，降低了生产成本，保证了批间稳定性，对疫苗产业化生产具有重要意义。

本发明还改进山羊痘疫苗现有抗原生产工艺技术，建立一种自发永生化的绵羊皮肤成纤维细胞系驯化及其培养方法，并将其用于山羊痘疫苗抗原传代细胞生产，弥补现有技术空白。解决了目前山羊痘疫苗抗原效价低、羊睾丸来源受限、容易引入外源病毒污染、生产工艺繁琐、生产成本高等诸多不利因素。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种绵羊皮肤成纤维细胞系，本发明利用孕3月龄的胎羊耳部皮肤进行原代皮肤成纤维细胞分离、纯化、连续传代培养，最终获得一株纯度高、能稳定传代的自发永生化绵羊皮肤成纤维细胞系，名称为绵羊皮肤成纤维细胞LSF-2，分类名称为绵羊皮肤成纤维细胞系，已经于2021年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为：CGMCC NO.23100。

具体的，本发明所述的绵羊皮肤成纤维细胞系LSF-2通过以下方式获得: