[发明专利]分泌抗鱼类CD28单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

说明书

本发明涉及一株分泌抗鱼类T淋巴细胞表面膜蛋白CD28单克隆抗体的杂交瘤细胞株1B6A2，杂交瘤细胞株1B6A2保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：C202291，保藏日期为2022年5月5日。其对于体外模拟第二信号，探究CD28介导的T细胞适应性免疫应答机制提供了有力的工具。

技术领域

本发明属于鱼类免疫学和病害防控领域，其涉及一种分泌抗鱼类T淋巴细胞表面膜蛋白CD28单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备方法，以及该单抗在硬骨鱼适应性免疫中的应用。

背景技术

T细胞是适应性免疫应答的执行者，通过释放效应因子、辅助B细胞产生抗体、杀伤靶细胞等过程，参与应答并清除病原。T细胞的活化需要第一信号和第二信号的共同刺激：第一信号是由CD3/TCR与APC表面的MHC-抗原肽复合物结合产生的特异性刺激信号；第二信号(共刺激信号)是APC表面的B7家族配体(CD80/CD86)与T细胞表面共刺激分子CD28相互作用，第一信号、第二信号启动不同的信号通路。高等脊椎动物CD28是免疫球蛋白超家族成员，由膜外功能区Ig结构域、跨膜区和带有信号基序的胞质内区域的组成。虽然中国专利申请202011478707.5、“抗罗非鱼T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε单克隆抗体的制备方法和应用”涉及T淋巴细胞表面膜蛋白CD3ε单克隆抗体的制备方法，但需要注意的是，尽管CD28在结构上与CD3ε相似，但CD28介导不同的下游信号和免疫事件，如，CD28驱动免疫突触的生物事件、下游的磷酸化和翻译后修饰、转录变化和细胞骨架重塑以及关键的细胞因子、趋化因子和生存信号的产生，对T细胞的长期扩增和分化至关重要。此外，CD28信号还能够调控新陈代谢例如增加糖酵解率，产生增殖所需的能量。CD28介导的第二信号由第一信号触发并引导CD3-TCR信号的放大，降低其与MHC-多肽交联的TCR阈值，若缺乏共刺激分子提供的协同刺激信号，T细胞则不能被充分激活。而第二信号的缺失导致许多基因，尤其是编码IL-2的基因不能转录激活，导致T细胞不能增殖分化，而处于无能状态，甚至发生凋亡。此外，阻断T细胞活化的共刺激信号可负向调控T细胞活性，从而诱导T细胞产生免疫耐受。Anti-CD3联合anti-CD28刺激是目前为止高等动物中体外激活T细胞最有效的工具，然而单独的anti-CD3ε刺激并不能诱导T细胞的充分活化和增殖，这表明除了抗原刺激信号之外，无抗原特异性的CD28共刺激信号对T细胞的生物学功能的发挥是非常必要的。

与高等动物相比，目前鱼类T细胞的研究仍然处于起步阶段，尤其是关于T细胞的激活、增殖、分化及其效应功能。最大的限制因素是在鱼类缺乏有效的T细胞激活工具。目前在鱼类中主要用PHA和PMA+ionomycin研究T细胞的活化，但这种刺激缺乏特异性。而体外利用anti-CD3提供的单一信号刺激不足以完全诱导T细胞的激活和增殖。

尼罗罗非鱼生长速度快，具有广温性和广盐性的特点，是我国淡水养殖的主要品种。近十年来，由于我国罗非鱼养殖产业快速发展，其养殖产量、产值和出口量均位于世界第一。然而随着养殖密度的加大以及养殖环境的恶化引起了一系列的疾病，给尼罗罗非鱼的养殖造成了严重的损害。因此对于罗非鱼免疫机制的研究迫在眉睫,尤其是T细胞介导的适应性免疫应答。在尼罗罗非鱼中，CD28分子已经被克隆出来，经过无乳链球菌感染后，尼罗罗非鱼脾脏中CD28分子表达显著上调，说明CD28分子参与T淋巴细胞的激活，但具体的调控机制仍然不清楚。

发明内容

本发明针对目前鱼类T细胞研究现状以及单克隆抗体制备的困难，提供了一株能够稳定分泌抗鱼类CD28单克隆抗体的杂交瘤细胞株1B6A2、单克隆抗体及其制备方法和应用，其对于体外模拟第二信号，探究CD28介导的T细胞适应性免疫应答机制提供了有力的工具。

本发明为解决上述技术问题所提供的技术方案如下：