[发明专利]一种鸡胚成肌永生化细胞及其构建方法和应用在审
| 申请号： | 202310447264.0 | 申请日： | 2023-04-24 |
| 公开（公告）号： | CN116496992A | 公开（公告）日： | 2023-07-28 |
| 发明（设计）人： | 刘一帆;单艳菊;束婧婷;章明;姬改革;巨晓军;屠云洁;盛中伟;张海涛;张进;唐燕飞;邹剑敏;石诗影;庞立川;范晨宇 | 申请（专利权）人： | 江苏省家禽科学研究所;江苏立华牧业股份有限公司;广西富凤农牧集团有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N5/077;C12N15/85 |
| 代理公司： | 南京源点知识产权代理有限公司 32545 | 代理人： | 陈彩霞 |
| 地址： | 225000 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 鸡胚成肌 永生 细胞 及其 构建 方法 应用 | ||
1.一种鸡胚成肌永生化细胞，其特征在于，所述鸡胚成肌永生化细胞为JIPS-CPM，其保藏编号CCTCC NO: C202396。
2.一种权利要求1所述的鸡胚成肌永生化细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：取孵化至11胚龄的鸡胚，利用胰酶消化分离腿部成肌细胞；
S2：将所述成肌细胞利用差速贴壁法去除成纤维细胞，对细胞进行纯化，获得原代成肌细胞；
S3：利用电穿孔转染法将外源性的SV40t和hTERT共同导入所述原代成肌细胞，进一步筛选获得符合成肌细胞特征的鸡胚成肌永生化细胞。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1具体操作为，取11胚龄鸡胚用PBS清洗后，剥离腿肌并将肌肉剪碎后，加入含有EDTA的0.25%胰酶，于37℃恒温箱消化20min，随后加入生长培养基终止消化，离心去除胰酶后用所述生长培养基重悬细胞，分别用200目和400目滤筛过滤悬液，置于培养箱培养。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述生长培养基为DMEM+20%胎牛血清+1%青/链霉素。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S3具体操作为，将生长状态良好的所述原代成肌细胞以1*105/ml的密度接种于6孔板，继续培养至50%融合时，取线性化的pcDNA3.1-hTERT和pcDNA3.1-SV40T质粒，按照Lonza电转染程序及操作步骤转染细胞，待细胞达到80%融合时，将培养基更换为添加1μg/ml 嘌呤霉素的培养基继续培养，2d更换一次培养基，直至对照孔中的细胞完全死亡。
6.权利要求1所述的鸡胚成肌永生化细胞在构建禽类骨骼肌体外模型、肌肉发育等基因功能研究中的应用。
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