[发明专利]一种鸡胚成肌永生化细胞及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种鸡胚成肌永生化细胞及其建立方法和应用。所述的鸡胚成肌永生化细胞，命名为鸡胚成肌永生化细胞JIPS‑CPM，其保藏编号CCTCC NO:C202396。试验发现，JIPS‑CPM可以连续传代80代以上，且活性和生物学特性与原代细胞基本一致。本细胞系的构建采用hTERT和SV40t线性化后电转染方法，与常规细胞系构建方法相比，具有效果稳定和操作便捷的优势。本发明可广泛应用于禽类肌肉发育和品质调控等基因功能研究，能够显著降低因反复提取原代细胞的造成的培养成本，加快相关领域的研究进展，在家禽基础研究中具有明显的应用前景。

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，涉及一种鸡胚成肌永生化细胞及其建立方法和应用。

背景技术

骨骼肌是动物机体的最主要的组织类型，约占体重的40%。肌肉的生长发育性能已成为评价畜禽生产经济效益的首要指标。鸡肉是我国第二大的消费肉类，肉鸡业的发展良好与否直接关系居民肉类供应和农民增收。随着生活水平的提高，人们对鸡肉品质的要求也越来越高，这对肉鸡品种改良又提出新的要求。鉴于以上原因，鸡肌肉发育和品质调控已经成为肉鸡育种学者关注的热点。

成肌细胞（Myoblast）是一种位于肌细胞膜和肌膜之间的具有增殖和分化潜能的多能干细胞，能够增殖融合为多核肌管并最终分化为肌纤维，对于骨骼肌发育、修复和再生有着重要的意义。成肌细胞已经成为肌肉生长、肌肉疾病和肉质调控等研究的重要体外研究材料。成肌细胞的体外分离和培养最早可以追溯到上世纪六十年代，Mauro等首次在青蛙骨骼肌中分离获得成肌细胞。目前，在猪、羊以及鸡等物种上已经建立了较为成熟的原代成肌细胞体外分离培养方法，显著推动了相关研究领域的进展。但在实际研究中发现，原代成肌细胞往往只能稳定培养几个世代，传代世代过多普遍出现细胞形态改变和增殖速度放缓等现象。此外原代细胞分离提取费时耗力，试验效率受到很大影响。因此，建立具有永生化特性的成肌细胞，即可以长期传代且性状稳定的细胞，在当前肌肉功能研究领域尤其是家禽上有着实际的技术需求。

细胞永生化是指体外培养的细胞由于自身改变或者受到外界条件的影响，从增殖衰老危机中逃离，从而获得无限增殖能力的过程。细胞发生自发永生化的概率很低，构建永生化细胞系主要采取外源诱导的方法，包括化学物质、辐射诱变，病毒感染，端粒酶激活等。目前在鸡上完成永生化细胞系构建的仅有前脂肪细胞、成纤维细胞、肾细胞等，未见鸡成肌细胞永生化的相关报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种鸡胚成肌永生化细胞，传代至80代仍能保持较好的细胞活性和生物学特性，可大幅节省反复提取原代细胞的时间和经济成本，提高不同批次的重复性，提高相关研究的效率和准确性。

本发明的第二个目的是提供上述鸡胚成肌永生化细胞的构建方法。

本发明的第三个目的是提供上述鸡胚成肌永生化细胞的应用。

为了实现以上目的，本发明所采取的技术方案是：

第一方面，本发明提供了一种鸡胚成肌永生化细胞，所述鸡胚成肌永生化细胞为JIPS-CPM，其保藏编号CCTCC NO: C202396。本发明的鸡胚成肌永生化细胞，于2023年4月20日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

第二方面，本发明提供了一种所述的鸡胚成肌永生化细胞的构建方法，包括以下步骤：

S1：取孵化至11胚龄的鸡胚，利用胰酶消化分离腿部成肌细胞；

S2：将所述成肌细胞利用差速贴壁法去除成纤维细胞，对细胞进行纯化，获得原代成肌细胞；

S3：利用电穿孔转染法将外源性的SV40t和hTERT共同导入所述原代成肌细胞，进一步筛选获得符合成肌细胞特征的鸡胚成肌永生化细胞。