[发明专利]一种重组CA125基因工程抗原的构建方法和制备工艺

权利要求书

1.一种重组CA125基因工程抗原的构建方法和制备工艺，其特征在于：它包括以下步骤：

步骤一：利用基因重组技术，从CA125全长序列中选取了2段作为目的片段，将目的片段通过酶切连接到目的载体pET-52b质粒上，将pET-52b质粒转化入感受态细胞中，得到高表达的菌株，将得到的菌株放置于甘油菌中保存；

步骤二：取上述甘油菌于含有50ug/ml氨苄卡那霉素的固体LB培养基平板上划线，在37℃培养箱中放置12-16h，培养得到重组菌的单菌落；将获得的重组蛋白菌体放置于200ml含kan的液体LB培养基中，在37℃，220rpm摇床中悬浮培养至OD600为0.6-0.8时，加入诱导剂使培养液终浓度为1mM，继续在37℃下诱导表达4h；

步骤三：将诱导剂诱导表达的菌液，在4℃下，使用离心机以6500rpm/min离心5min，收集菌体沉淀；用PBS重悬，于冰浴中通过超声波细胞破碎机进行破碎；破碎完成后，4℃，使用离心机以12000rpm/min离心5min，收集包涵体沉淀；

步骤四：得到的包涵体沉淀用包涵体洗涤液A重悬，室温下，使用离心机以8500rpm/min离心5min，弃上清，重复清洗一次；再用包涵体洗涤液B清洗一次；得到包涵体沉淀再加入包涵体溶解液，重悬混匀后，超声波溶解10min，超声功率为100W，3s开，3s关。

步骤五：将溶解后的包涵体用稀释液稀释50倍；使用10k超滤管将稀释后的包涵体溶解液进行浓缩，浓缩至蛋白浓度1mg/ml以上时，向超滤管中加入10倍体积的缓冲液，继续超滤浓缩；重复3次完成换液；得到重组CA125基因工程抗原；

步骤六：利用化学免疫分析方法，吖啶酯化学发光平台进行检测CA125活性；

所述步骤一中选取的2段目的片段为重复频率高且存在特异性的重复序列。

2.根据权利要求1所述的一种重组CA125基因工程抗原的构建方法和制备工艺，其特征在于：所述步骤一种的感受态细胞为BL21。

3.根据权利要求1所述的一种重组CA125基因工程抗原的构建方法和制备工艺，其特征在于：所述步骤二中的诱导剂为异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷。

4.根据权利要求1所述的一种重组CA125基因工程抗原的构建方法和制备工艺，其特征在于：所述步骤三中PBS由20mM PB、150mM NaCl组成。

5.根据权利要求1所述的一种重组CA125基因工程抗原的构建方法和制备工艺，其特征在于：所述步骤三中超声波细胞破碎机的破碎时间为30min，超声功率为250W，3s开，3s关。

6.根据权利要求1所述的一种重组CA125基因工程抗原的构建方法和制备工艺，其特征在于：所述步骤四中包涵体洗涤液A为20mM Tris，1mM EDTA，2M Urea，50mM NaCl，1％Triton X-100，pH8.0。

7.根据权利要求1所述的一种重组CA125基因工程抗原的构建方法和制备工艺，其特征在于：所述步骤四中包涵体洗涤液B为20mM Tris，1mM EDTA，50mM NaCl，pH8.0。

8.根据权利要求1所述的一种重组CA125基因工程抗原的构建方法和制备工艺，其特征在于：所述步骤四中包涵体溶解液为20mM Tris，5mM DTT，6M Urea，0.01％SDS，pH 9.5。

9.根据权利要求1所述的一种重组CA125基因工程抗原的构建方法和制备工艺，其特征在于：所述步骤五中稀释液为20mM Tris，0.1％β-CD，0.4M L-Arg，PH8.5。

10.根据权利要求1所述的一种重组CA125基因工程抗原的构建方法和制备工艺，其特征在于：所述步骤五中缓冲液为20mM Tris，150mM NaCl，PH8.0。