[发明专利]一种重组CA125基因工程抗原的构建方法和制备工艺

说明书

一种重组CA125基因工程抗原的构建方法和制备工艺，涉及基因工程技术领域，具体涉及一种重组CA125基因工程抗原的构建方法和制备工艺。一种重组CA125基因工程抗原的构建方法及制备工艺，它包括以下步骤：步骤一：利用基因工程手段，从CA125全长序列中选取了2段作为目的片段，将目的片段通过酶切连接到目的载体pET‑52b质粒上，将pET‑52b质粒转化入感受态细胞中，得到高表达的菌株；采用上述技术方案后，本发明有益效果为：工艺流程简单，周期短，所需试剂以及材料容易获得；表达CA125抗原活性高，达到400KU；CA125产量高，每升菌可得到127mg蛋白。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种重组CA125基因工程抗原的构建方法和制备工艺。

背景技术

MUC16基因，又称CA125，该基因位于人类染色体19p13.2上，由179kb的基因组DNA编码。MUC16是一种I型跨膜蛋白，主要包含三个部分：N端结构域、串联重复结构域和C端结构域。N端结构域长度约12,000个氨基酸；TR结构域包含18个-60个可变数目的串联重复序列，每个重复序列有156个氨基酸，包含56个海胆精子蛋白-肠激酶-聚集蛋白结构域以及两个锚蛋白域；C端结构域由284个氨基酸组成，又可以分为细胞外部分、单次跨膜结构域，细胞质尾端结合域和推定的核定位信号RRRKK。附着于卵巢癌细胞表面的蛋白会发生变化，其长度可能会截短，或者其侧链的改变，这些都将导致正常细胞与卵巢癌细胞的糖基化模式不同，因此，CA125蛋白可以作为筛查卵巢癌等癌症的特异性标志物。

随着生物技术的发展，蛋白抗原获取的方式也丰富多样。有从细胞、组织、组织液及体液分离提取蛋白，如CA125可以从卵巢癌病人腹水中提取获得。但这种方式提取的蛋白纯度不高，而且在分离纯化的过程中蛋白容易发生变性和降解，用来制备的抗体可能无法识别天然蛋白。也有通过生物分析软件对蛋白的相关抗原性信息进行分析后，直接合成蛋白抗原表位，此方法获取抗原快速，而且蛋白纯度高，但是成本高，合成的多肽需要特殊的仪器，不易推广。采用基因重组技术，将目的基因克隆至宿主细胞，然后启动宿主细胞目的蛋白的表达，经过纯化得到的目的蛋白抗原。此方法简便、快速、成本低，而且易于批量生产。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种重组CA125基因工程抗原的原核构建方法和制备工艺，它满足表达抗原活性的同时，蛋白产量有极大的提升。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案是：一种重组CA125基因工程抗原的构建方法及制备工艺，它包括以下步骤：

步骤一：利用基因工程手段，从CA125全长序列中选取了2段作为目的片段，将目的片段通过酶切连接到目的载体pET-52b质粒上，将pET-52b质粒转化入感受态细胞中，得到高表达的菌株，将得到的菌株放置于甘油菌中保存；

步骤二：取上述甘油菌于含有50ug/ml氨苄卡那霉素的固体LB培养基平板上划线，在37℃培养箱中放置12-16h，培养得到重组菌的单菌落；将获得的重组蛋白菌体放置于200ml含kan的液体LB培养基中，在37℃，220rpm摇床中悬浮培养至OD600为0.6-0.8时，加入诱导剂使培养液终浓度为1mM，继续在37℃下诱导表达4h；

步骤三：将诱导剂诱导表达的菌液，在4℃下，使用离心机以6500rpm/min离心5min，收集菌体沉淀；用PBS重悬，于冰浴中通过超声波细胞破碎机进行破碎；破碎完成后，4℃，使用离心机以12000rpm/min离心5min，收集包涵体沉淀；

步骤四：得到的包涵体沉淀用包涵体洗涤液A重悬，室温下，使用离心机以8500rpm/min离心5min，弃上清，重复清洗一次；再用包涵体洗涤液B清洗一次；得到包涵体沉淀再加入包涵体溶解液，重悬混匀后，超声波溶解10min，超声功率为100W，3s开，3s关。