[发明专利]一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌B.S168△2为出发菌株，在构建敲除胞外蛋白酶基因菌株的基础上，通过过表达普鲁兰酶基因amyX得到的。

2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌B.S168△2是枯草芽孢杆菌B.subtilis 168的改造菌株，即在原始菌株的基础上敲除了两个蛋白酶基因htrC和aprX。

3.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的胞外蛋白酶基因为aprE、epr、bpr、mpr、nprE、nprB、vpr和wprA中的任意一种或几种的组合；优选地，所述的胞外蛋白酶基因为aprE、epr、bpr、mpr、nprE和nprB的组合，或aprE、epr、bpr、mpr、nprE、nprB和vpr的组合，或aprE、epr、bpr、mpr、nprE、nprB、vpr和wprA的组合；最优选地，所述的胞外蛋白酶基因为aprE、epr、bpr、mpr、nprE、nprB和vpr的组合。

4.根据权利要求3所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的胞外蛋白酶基因aprE、epr、bpr、mpr、nprE、nprB、vpr和wprA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13和15所示，相对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14和16所示。

5.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的普鲁兰酶基因amyX来源于枯草芽孢杆菌B.subtilis 168，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示。

6.权利要求1-5任意一项所述的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)出发菌株B.S168△2的构建：通过敲除枯草芽孢杆菌B.subtilis 168的蛋白酶基因htrC和aprX，获得出发菌株B.S168△2；

(2)胞外蛋白酶基因敲除菌株的构建：通过迭代敲除出发菌株B.S168△2的胞外蛋白酶基因，获得胞外蛋白酶基因敲除菌株；

(3)过表达普鲁兰酶基因amyX：对步骤(2)获得的胞外蛋白酶基因敲除菌株过表达普鲁兰酶基因amyX，构建枯草芽孢杆菌表达普鲁兰酶底盘菌株，即重组枯草芽孢杆菌。

7.权利要求1-5任意一项所述的重组枯草芽孢杆菌在发酵产普鲁兰酶中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的发酵，其发酵培养基为Terrific肉汤培养基、Super Broth培养基、罐子发酵培养基和Luria-Bertani培养基中的任意一种；优选地，发酵培养基为罐子发酵培养基，其配方为：糯米淀粉2g/L，蛋白胨3g/L，KH₂PO₄0.05g/L，MgSO₄·7H₂O 0.01g/L，MnSO₄·7H₂O 0.01g/L，pH 6.0。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的发酵，其发酵条件为：35℃，160rpm培养2-5d。

10.权利要求1-5任意一项所述的重组枯草芽孢杆菌作为底盘菌株在构建发酵产普鲁兰酶的基因工程菌中的应用。