[发明专利]一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。本发明利用CRISPR/cas9技术，先构建出了敲除产孢膜丝氨酸蛋白酶htrC和碱性丝氨酸蛋白酶aprX的出发菌株B.S168△2，再以出发菌株B.S168△2为基础，构建出了八种敲除胞外蛋白酶基因的底盘细胞B.S168△3、B.S168△4、B.S168△5、B.S168△6、B.S168△7、B.S168△8、B.S168△9和B.S168△10，并进一步筛选出了无抗性残留，转化效率高、几乎无胞外蛋白酶且不会影响胞外目的蛋白积累的底盘细胞B.S168△8、B.S168△9和B.S168△10，随后在此基础上又筛选出了最适合分泌表达普鲁兰酶的底盘菌株B.S168△9，构建出的重组菌株B.S168△9amyX相比于原始菌株B.S168的酶活有显著提升。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

近年来，基于代谢工程技术和合成生物学方法构建的微生物底盘细胞已经被广泛应用于生产各种天然高附加值化学品、优质清洁能源和生物材料。合成生物学旨在针对唯一目标或产物，对自然界中不存在的途径或生产宿主进行创造，或对自然界中已经存在的生命系统进行改造，以满足合成和生产需求。合成生物学主要结合了生物学、化学、热力学等多学科知识，对已发掘的生物元件进行一系列解析、组装及协调，创建生产宿主。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为一种典型的革兰氏阳性细菌和模式工业微生物，常被用作细菌遗传学及细胞代谢研究的模式菌株。Bacillus subtilis具有非致病性、强大的胞外分泌蛋白能力以及无明显的密码子偏爱性等优点，并且是一种GRAS(generally recognized as safe)级食品安全宿主菌，拥有生理生化特征清晰，遗传操作较为简单，分泌及表达能力强，培养发酵较为方便等优点，在功能营养品、精细化学品和酶制剂的生产中具有广泛应用。B.subtilis作为一种重要的工业生产菌株，通过代谢工程改造已开发出不同类型的底盘细胞，被改造为微生物细胞工厂，用于生产工业酶、维生素、功能糖、保健品及药物前体等目标产物，表现出了强大的工业生产应用能力。

但是由于B.subtilis 168表达的异源蛋白质容易被其自身分泌的内源性蛋白酶降解，因此利用B.subtilis 168细胞系统表达异源蛋白的能力有限，只能产生低产量的目的蛋白。因此，大部分研究人员选择蛋白酶缺陷菌株B.subtilis WB800N作为出发菌株。然而，B.subtilis WB800N也存在某些问题，比如转化效率极低，带新霉素抗性基因等。相较于大肠杆菌(Escherichia coli)，B.subtilis底盘细胞的开发还存在较明显的滞后。因此，应用合成生物学手段，构建出一个敲除胞外蛋白酶的B.subtilis底盘细胞以优化生产具有重要的科学意义与应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种安全的、操作过程更简单的、能高效分泌表达普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述重组枯草芽孢杆菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述重组枯草芽孢杆菌在发酵产普鲁兰酶中的应用和作为底盘菌株在构建发酵产普鲁兰酶的基因工程菌中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种重组枯草芽孢杆菌，是一种底盘菌株，是以枯草芽孢杆菌B.S168△2为出发菌株，在构建敲除胞外蛋白酶基因菌株的基础上，通过过表达普鲁兰酶基因amyX得到的。

其中，所述的枯草芽孢杆菌B.S168△2是枯草芽孢杆菌B.subtilis 168的改造菌株，即在原始菌株的基础上敲除了两个蛋白酶基因htrC和aprX。。

具体的，所述的蛋白酶基因htrC、aprX，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17和19所示，相对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.18和20所示。