[发明专利]快速广谱检测支原体的引物探针组合、试剂盒及其应用

权利要求书

1.快速广谱检测支原体的引物探针组合，其特征在于，包括10条正向引物，5条反向引物和4条检测探针；10条所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-10所示，5条所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11-15所示，4条所述检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.16-19所示；所述检测探针的5’端还偶联有第一荧光标记，3’端还偶联有淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述第一荧光标记为FAM、TET、NED、ROX、CY3、CY5、VIC、JOE或HEX荧光标记；所述淬灭基团为MGB、TAMRA、NFQ、ECLIPSE、DABCYL、BHQ1或BHQ2淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于，所述第一荧光标记为FAM荧光标记，所述淬灭基团为MGB淬灭基团。

4.权利要求1-3任一项所述的引物探针组合在制备用于快速广谱检测支原体的产品中的应用。

5.用于快速广谱检测支原体的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的引物探针组合，还包括内控质粒和相应的内控探针，所述内控质粒和内控探针用于监测检测支原体时待测样品中的PCR抑制现象。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述内控质粒的目标片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述内控探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；所述内控探针的5’端偶联有与所述第一荧光标记不同的第二荧光标记，3’端偶联有淬灭基团。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括qPCR反应液、阳性对照和PCR级别水。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述qPCR反应液含有PCR缓冲液、dNTPs、热启动Taq聚合酶和MgCl₂；所述阳性对照为含有肺炎支原体和口腔支原体的基因组的缓冲液。

9.一种不以疾病诊断和治疗为目的的快速广谱检测支原体的方法，其特征在于，采用权利要求5所述的试剂盒；用于定性检测采样样品、生物制品中的支原体污染。

10.根据权利要求9所述的快速广谱检测支原体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、取待测样品配制成供试品，将所述内控质粒加至供试品或qPCR反应液中；

将内控质粒用无菌生理盐水配制成阴性对照；将阳性对照基因组加入内控质粒和无核酸酶水并稀释配制成阳性对照；将内控质粒用无核酸酶水配制成无模板对照；

分别提取所述供试品和阴性对照中的核酸；

S2、在荧光定量PCR仪上创建所述第一荧光标记和第二荧光标记双通道，对供试品、阴性对照、阳性对照和无模板对照分别进行qPCR反应，分别读取双通道的Ct值；

S3、针对Ct值进行结果判定；

若支原体的第一荧光标记通道的Ct值40且有正常扩增曲线，则判定为支原体阳性；

若支原体的第一荧光标记通道和内控的第二荧光标记通道均无Ct值，则判定为PCR抑制；

若支原体的第一荧光标记通道无Ct值，内控的第二荧光标记通道Ct值40且有正常扩增曲线，则判定为支原体阴性；

若支原体的第一荧光标记通道Ct值≥40且有正常扩增曲线，内控的第二荧光标记通道Ct值40且有正常扩增曲线，则判定检测结果无效；

若支原体的第一荧光标记通道Ct值≥40且有正常扩增曲线，内控的第二荧光标记通道无Ct值，则判定为PCR抑制。