[发明专利]快速广谱检测支原体的引物探针组合、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种快速广谱检测支原体的引物探针组合、试剂盒及其应用，涉及支原体检测技术领域。引物探针组合包括10条正向引物，5条反向引物和4条检测探针；正向引物序列如SEQ ID NO.1‑10所示，反向引物序列如SEQ ID NO.11‑15所示，检测探针序列如SEQ ID NO.16‑19所示；本发明提供了用于广谱检测支原体的试剂盒和检测方法，试剂盒中包括内控质粒和内控探针。试剂盒中的引物探针所检测的支原体种类覆盖度广，可以检测132种、410株支原体，检测限0.1‑0.5copies/μl，灵敏度可达10CFU/ml以下；能监测样品中可能存在的PCR抑制情况，避免假阴性出现。

技术领域

本发明涉及支原体检测技术领域，特别涉及快速广谱检测支原体的引物探针组合、试剂盒及其应用。

背景技术

“支原体”通常被用作柔膜菌纲中所有细菌的惯用名，是一类无细胞壁、形态多样可变，大小介于细菌和病毒之间(直径0.1-0.3μm)的原核微生物。目前已从污水、植物、动物、禽类、昆虫、人、温泉或其他高温环境中发现200多种支原体。支原体的基因组大小为0.58-2.2Mbp，碱基GC含量较低(23-40mol％)，可自由生活进行二分裂繁殖，也可在细胞膜上共生或细胞内寄生，并具有宿主细胞特异性。支原体感染宿主细胞主要有三个方面的机理：细胞黏附、细胞侵入和细胞融合。细胞受到支原体感染后，可能无明显表型变化，也可能生长速度变慢，产生细胞病变效应，甚至发生染色体畸变和细胞恶化。受支原体污染的生物制品可引起人类多种疾病，威胁人类健康。支原体污染来源广泛，操作人员与污染细胞来源的支原体污染概率最大。据文献报道，连续培养细胞系中支原体的污染率约为15-35％，在生物制药行业中约为0.44-6.70％，95％以上的污染是由以下几种支原体引起：口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginini)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、发酵支原体(M.fermentans)、人型支原体(M.hominis)和莱氏无胆甾原体(A.laidlawii)。各国法规和监管部门都明确规定：源于细胞培养的产品都必须确保无支原体污染。

常见的支原体检测方法包括培养法、指示细胞法、电镜观察法、免疫检测法、生化测定法、核酸扩增技术(NAT)等。目前，各国药典中支原体检测普遍使用的是培养法和指示细胞法。培养法是最经典的支原体分离和检测方法，又称28天培养法，灵敏度可以达到1-10cfu/mL，劣势在于培养时间长，需要使用多种培养基对不同的支原体种类进行检测，并且对于一些难培养的支原体(比如猪鼻支原体)容易出现漏检的现象。指示细胞法在时间上(3-5d)比培养法有一定的优势，但灵敏度不及培养法，且只能检测细胞粘附支原体，对于粘附性较差的口腔支原体和精氨酸支原体，则很容易形成假阴性结果，也不适用于能使指示细胞发生病变的病毒样品。不管是培养法还是指示细胞法，都不适用于对时效性要求较高的嵌合抗原受体T细胞等特殊的细胞治疗类产品的快速放行检测。

NAT法是基于支原体核酸序列(DNA/RNA)的扩增，根据原理分为RT-PCR，PCR/Nested-PCR/Touch Down-PCR、qPCR和恒温扩增法。NAT法因其便捷快速、灵敏度高、特异性好，已被欧洲药典和日本药典所采用，美国药典中也明确说明可以使用经过验证的NAT法或依赖酶活性的方法检测支原体，但要求新方法要与药典方法有可比性。qPCR(荧光定量PCR)主要优势在于可以通过阈值循环数(Ct)值准确评估起始模板量，可以实现高通量和同一个反应孔多通道检测，特异性好，灵敏度高，准确性好，检测种类多，被广泛用于国内外生物制品的质控检测。

发明内容