[发明专利]一种提高他克莫司产量的方法

说明书

本发明提供一种提高他克莫司产量的方法。其特征在于，将筑波链霉菌用氧化剂处理，得到氧化应激孢子，再将氧化应激孢子接入发酵培养基，按常规方法发酵，获得含他克莫司发酵液，将发酵液分离纯化即可。

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，尤其涉及一种提高他克莫司产量的方法。

背景技术

他克莫司(tacrolimus)，是一种由链霉菌发酵生产的聚酮类化合物，主要作为免疫抑制剂用于器官移植、系统性红斑狼疮、特异性皮炎等。他克莫司体外活性约为环孢菌素的100倍，排异反应发生率显著降低，且严重不良反应发生率更低，目前已在多个国家上市，是器官移植手术中的临床一线用药。

虽然有全化学合成的方法合成他克莫司的方法，但是由于其步骤复杂且收率不高。目前主要采用微生物发酵的方法生产他克莫司，生产菌株主要来自链霉菌属。Goranovic等在菌株S.tsukubaensis NRRL 18488分别过表达fkbN和tcs7基因，将他克莫司的效价较野生型分别提升了55％和30％。(M,MAGDEVSKAV,et al.他克莫司biosynthesis is regulated by two positive regulatory elements inStreptomyces tsukubaensis[J].BMC microbiology,2012,12:1-15.)郑荣军等使用他克莫司的前体或结构类似物对他克莫司产生菌进行理性化选育，最终筛选得到一株较出发菌他克莫司效价提高2倍的菌株(郑军荣,乐占线,魏元刚,etal.他克莫司高产菌株的理性化选育[J].中国抗生素杂志,2011,36(10):745-50.)。严凌斌等通过响应面法优化培养基中的无机盐组成，将他克莫司产量提高了77.0％，达到1037mg/L。(严凌斌,张祝兰,张引,etal.响应面法优化他克莫司发酵培养基中无机盐组合[J].中国抗生素杂志,2020,45(10):994-9.)

现有的研究主要使用菌种选育以及合理的饲养策略来提高他克莫司的发酵产量。中国专利CN 113373075A提到了一种提高筑波链霉菌产孢量的方法，在平板中添加N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺或N,N-二乙基甲酰胺，提高了筑波链霉菌产孢子的量及产孢子的稳定性。但是目前对提高孢子质量的研究仍然较少，平板孢子的培育是发酵过程中的第一步，平板种子的质量对后续的发酵过程至关重要。

他克莫司是一种具有抗氧化性的刺激代谢产物。微生物的次级代谢与细胞内的氧化还原状态有关。过氧化氢等氧化物质刺激后，可诱导胞内多种抗氧化酶表达提高。

本发明使用过氧化氢刺激菌株产生氧化应激孢子，提高菌株的他克莫司生物合成能力。

发明内容

本发明提供一种提高他克莫司产量的方法。其特征在于，将筑波链霉菌用氧化剂处理，得到氧化应激孢子，再将氧化应激孢子接入发酵培养基，按常规方法发酵，获得含他克莫司发酵液，将发酵液分离纯化即可。实验证明，该方法能有效地提高筑波链霉菌合成他克莫司的单位产量，具有重要的应用价值，解决了发酵效率低的问题。

优选的，所述氧化剂处理包含以下步骤：

A将筑波链霉菌接至平板培养基，温度20-30℃培养7-10d，得到筑波链霉菌孢子，用无菌水洗脱孢子，经研磨稀释得到孢子悬液；

B将孢子悬液接入种子培养基中，温度28℃，转速200-300rpm，培养24-60h，得到筑波链霉菌种子液；

C在发酵培养基中加入氧化剂，摇匀后迅速加入上一步获得的种子液，温度20-30℃，转速200-300rpm培养1-7d，获得氧化剂处理的发酵液；

D取步骤C获得的发酵液加入无菌水稀释至适当菌体细胞浓度，混匀后涂布培养平板，20-30℃培养，得到氧化应激孢子。