[发明专利]一种提高紫花苜蓿耐盐的方法

权利要求书

1.一种提高紫花苜蓿耐盐的方法，其特征在于，包括：

S1、供试菌株、Cp2-EPS及紫花苜蓿品种

供试菌株(根瘤菌)由紫花苜蓿“巨能551”成熟根瘤分离得到，菌株保存温度为-80℃，Cp2-EPS常温保存，紫花苜蓿种样于4℃恒温条件下保存；

S2、根瘤菌耐盐性测定

通过酵母膏液体培养基，分别设置0‰、5‰、10‰、15‰、20‰、25‰、30‰、35‰、40‰、50‰的NaCl处理，以酵母膏液体基础培养基为对照，恒温震荡培养(28℃，180转)48h，分光光度计600nm处测定OD值，值为0.1表现为耐受性；

S3、种子处理及培养液制备

挑选足够的籽粒饱满、无病虫害的干净种子，配置50mmolNaCl和多种不同浓度的Cp2-EPS混合溶液，以190mL分装于生长瓶中在高温高压灭菌锅(121℃，0.11Mpa)灭菌21min后待用，以无菌水配置菌悬液(OD600＝0.12)，10mL加入生长瓶，确定为种子萌发和幼苗生长的培养液；

S4、种子萌发试验

将挑选好的种子用95％的乙醇表面消毒，后用5％的NaClO浸泡5min，并依次用无菌水洗涤，培养皿中铺放3层滤纸，加入培养液完全浸湿，均匀放入50粒种子，重复制作4个，用封口膜包裹培养皿，置于光照培养箱中，温度25±1℃、湿度60％、光强4000lx条件下培养，记录每天发芽种子数；

S5、幼苗生长试验

将S4步骤中处理后的种子等距置于生长瓶的发芽床上，每瓶25粒，重复制作8个，生长瓶置于温度23℃、湿度45％、光照(18Klux)18h、黑暗6h的生长室进行培养，14d时取样测定指标。

S6、指标测定

种子发芽率(％)＝第10d发芽的种子数/25×100％；发芽势(％)＝第5d发芽的种子数/25×100％；发芽指数＝∑Gt/Dt(Gt:第td天的发芽数；Dt:相应的发芽日数)。

2.根据权利要求1所述的一种提高紫花苜蓿耐盐的方法，其特征在于：所述S3步骤中多种不同浓度的Cp2-EPS混合溶液为五种，所述五种Cp2-EPS混合溶液为0g.L-1、0.6g.L-1、0.9g.L-1、1.2g.L-1、1.5g.L-1。

3.根据权利要求1所述的一种提高紫花苜蓿耐盐的方法，其特征在于，所述S6步骤指标测定还包括：

鲜重和干重的测定：各处理每瓶随机选取10株幼苗，滤纸吸干表面水分后称其鲜重，测完鲜重后将幼苗放置烘箱，75℃烘48h至恒重后称重即为干重；

地上长度和地下长度的测定：各处理随机选取16株幼苗，根基部以上为地上长度，以下为地下长度；

根系形态指标：将幼苗根系用蒸馏水冲洗干净，每个处理取16株。通过根系扫描仪扫描，输出的图片使用Win-RHIZO根系分析系统软件(RegentInstrumentsCanadaInc)进行分析，分别得出总根表面积(Surfacearea，SA，单个测量植株的所有根的面积，cm2)、总根体积(Rootvolume，RV，单个测量植株的所有根总体积，cm3)、平均根直径(Averagediameter，AD，单个测量植株的所有根的平均直径，cm)，根尖数(Forks，个)；

叶绿素含量参考WASSIE等的方法测定；

电导率参照Dacosta等的方法测定；

可溶性糖(SS)含量采用蒽酮比色法；脯氨酸(Pro)含量采用磺基水杨酸法；丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸法；过氧化氢(H2O2)采用硫酸钛法；超氧化物歧化酶(SOD)采用氮蓝四唑(NBT)光还原法；过氧化氢酶(CAT)采用紫外吸收法。

4.根据权利要求1所述的一种促进紫花苜蓿结瘤和生长的方法，其特征在于还包括如下步骤：

数据分析

通过SPSS23.0进行单因素方差法统计分析，计算平均值和平均值的标准误差，由最小显著差异(p＜0.05)检验确定，并进行数据整理和绘图。