[发明专利]一种固定化双酶树脂及其制备方法与应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种固定化双酶树脂及其制备方法与应用。本发明的固定化双酶树脂简单、酶活回收率高达90％以上、蛋白回收效率达65％。多次使用后固定化双酶树脂的活力剩余高、转化率高，蛋白载量可达250mg/g，明显高于已有报道的通过包埋(20mg/g)等固定化方法的蛋白载量。本发明的固定化双酶树脂酶活高、循环稳定性高、有效提高辅酶的循环利用，具有机械强度高、生物相容性好、环境耐受性强、不易失活、稳定性高的优良特性。本发明的固定化双酶树脂用于催化制备(R)‑二氢‑4‑丙基‑2(3H)‑呋喃酮具有产物选择性高、工艺操作简单、固废和产品损失低、产品收率高，有效降低反应成本等优势。

技术领域

本发明属于生物技术领域，进一步涉及固定化酶技术领域，具体涉及一种固定化双酶树脂及其制备方法与应用。

背景技术

布瓦西坦(Brivaracetam)(化学名称为(2S)-2-[(4R)-2-氧代-4-丙基-1-吡咯烷基]丁酰胺)是左乙拉西坦的结构衍生物，为比利时优时比(UCB)最新开发的第三代抗癫痫药物。能与突触囊泡糖蛋白2a结合，亲和力较左乙拉西坦强15～30倍，更有效地降低部分性癫痫发作的频率。分别于2016年1月和2月被欧洲EMEA和美国FDA批准上市，用于治疗成人和16岁以上青少年癫痫患者的部分发作、伴有或不伴有继发全身发作的辅助治疗。

对布瓦西坦的合成方法已有较多研究，涉及化学法不对称合成、化学法手性拆分、酶法不对称合成和酶法手性拆分。由于布瓦西坦存在两个手性中心，化学合成法往往涉及复杂的对映体分离与纯化，成本较高；酶法手性拆分具备温和条件，降低手性化合物纯化成本，但其理论转化率只有50％。近几年，生物酶法的不对称合成技术不断地被开发应用，逐渐被应用到布瓦西坦中间体的合成中。

酶的固定化能促使酶与反应体系分离，实现酶的循环使用，同时增加了酶对环境的耐受性。现有的固定化酶方法可分为物理作用力固定和化学共价键结合固定等。依赖于物理作用力的固定化方式主要包括包埋、吸附、离子键合等，由于其不会破坏蛋白的三维结构，往往能获得较高的酶活回收率。但由于物理作用力相对较弱，不稳定，其固定的蛋白容易脱落，影响固定化酶的循环稳定性。而化学键共价连接主要包括载体与酶的共价连接和酶之间的共价交联等。与借助物理作用力的固定化方式不同，共价连接直接通过化学键共价的方法将酶与载体结合。因其共价键的相互作用较强，所制得的固定化酶的循环稳定性较好。但由于共价连接的氨基酸残基容易残留在酶的内部，同时其能够催化活性口袋，致使其对酶的结构和催化功能造成破坏，进一步导致酶活回收率偏低。

发明内容

本发明是为了克服现有技术中制备的固定化烯还原酶与醇脱氢酶的双酶体系酶活偏低、循环稳定性差、难以实现辅酶的循环利用、环境耐受性较差、催化效果差的缺陷，提供了一种固定化双酶树脂及其制备方法，并将其应用于不对称还原制备布瓦西坦中间体中。

为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种固定化双酶树脂，包括树脂载体以及连接在所述树脂载体上的烯还原酶以及醇脱氢酶。

烯酮还原酶能够立体选择性不对称加氢被激活的C＝C，即由吸电子基团激活的C＝C，如α,β-不饱和羰基化合物中的C＝C，一次加氢反应可引入两个潜在的手性中心，用于高效合成光学纯饱和氰化合物、光学纯硝基烷烃以及光学纯饱和醛或酮类化合物等。烯酮还原酶是手性分子生物催化合成的重要酶类之一，该酶广泛存在于微生物中，尤其是细菌、真菌及植物中。烯酮还原酶催化反应过程是基于反式加氢的原则，同时在还原型辅酶Ⅰ(NADH)或者还原型辅酶Ⅱ(NADPH)当作辅酶的条件下，不对称加氢C＝C，产生辅酶因子NAD(P)⁺。为了使加氢反应不断进行，需要对这种辅酶因子进行再生反应，通常利用醇脱氢酶、甲醛脱氢酶或葡萄糖脱氢酶等脱氢酶类作为辅助催化剂，利用相对应的醇、甲酸或葡萄糖等廉价底物来实现辅酶因子的再生。因此，烯酮还原酶被用于生物催化过程，通常还需要辅酶再生系统的辅助，也即需要构筑双酶系统。有鉴于此，以简单方便且易于操作的方式建立双酶固定化方法，同时实现高酶活回收率和高循环稳定性，具有一定的应用价值。