[发明专利]一种羊小肠粘膜糖蛋白的提取分离纯化方法及其应用

权利要求书

1.一种羊小肠粘膜糖蛋白的提取分离纯化方法，其特征在于按下列步骤进行：

羊小肠粘膜糖蛋白的提取：

a、取新鲜羊小肠，用自来水清洗肠腔内容物，剥除脂肪和结缔组织，于小肠中间划开，刮取其粘膜，在温度-80℃，压力25Mpa下冷冻干燥48小时得到冻干粉，将冻干粉用研钵研磨得到羊小肠粘膜粉末；

b、在温度4℃-37℃，以料液比1:20-1:50 g/mL，将步骤a所得的羊小肠粘膜粉末加入含0.5%-3%氯化钠溶液、0.01-0.1M PBS溶液、0.5-1.0 mM苯甲基磺酰氟的磷酸盐缓冲液，搅拌提取1-4h，重复3次，用纱布过滤，合并提取液；

c、将步骤b所得提取液在温度-80℃，压力25Mpa下冷冻干燥48小时，得到羊小肠粘膜粗提物；

d、将步骤c所得的粗提物溶于水，并用1000Da-4000Da的透析袋，温度4℃脱盐48小时，冷冻干燥，得羊小肠粘膜粗糖蛋白；

羊小肠粘膜糖蛋白的分离纯化：

e、将步骤d所得的羊小肠粘膜粗糖蛋白用0.05M磷酸缓冲液溶解，吸附到用缓冲液冲洗平衡下的DEAE-650M阴离子交换层析柱上，流速4mL/min，依次用0.05M磷酸缓冲液配置的0-0.8M 氯化钠溶液洗脱，洗脱液在280nm处检测蛋白质的吸收，通过苯酚-硫酸法在490nm处检测糖的特征吸收，选择蛋白和糖吸收互相重叠的洗脱峰为糖蛋白，收集洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥，得到6个糖蛋白组分，分别命名为F1-F6；

f、采用2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠（BCA）法对步骤e所得的6个糖蛋白组分进行蛋白含量测定，将F5配置成浓度10-20mg/mL的样品溶液，上样HW-55F凝胶层析柱，超纯水为洗脱液洗脱，洗脱液在280nm处检测蛋白质的吸收，通过苯酚-硫酸法在490nm处检测糖的特征吸收，选择蛋白和糖吸收互相重叠的洗脱峰为糖蛋白，收集洗脱液，冷冻干燥，即得一个纯度较高的糖蛋白F5-1；

g、将步骤f所得糖蛋白F5-1溶于超纯水，用0.45μm滤头过滤，进样TSK gel G2000SW_XL 7.8×30mm，7μm高效液相色谱柱，流动相：超纯水，进样量：20μL,洗脱液流速0.8mL/min，获得较高纯度的糖蛋白，再次在相同色谱条件下进样，重复3次，收集冻干得到羊小肠粘膜糖蛋白单体化合物F5-1a。

2.根据权利要求1所述的方法获得的羊小肠粘膜糖蛋白在抑制结肠癌细胞药物中的用途。

3.根据权利要求1所述的方法获得的羊小肠粘膜糖蛋白在抑制结肠癌细胞生长的保健品中的用途。

4.根据权利要求1所述的方法获得的羊小肠粘膜糖蛋白在抑制结肠癌细胞生长的食品中的用途。