[发明专利]牛源化CRISPR/boCas13a基因编辑系统、方法及应用

说明书

本发明公开了一种牛源化CRISPR/boCas13a基因编辑系统、方法及应用。一种牛源化CRISPR/boCas13a基因编辑系统，包括boCas13a蛋白和crRNA；编码所述boCas13a蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过密码子优化策略，对韦氏纤毛菌来源的Cas13a基因，根据牛细胞中的密码子编码偏好性进行全局优化，实现了韦氏纤毛菌来源的Cas13a基因在牛来源细胞中的高效基因编辑，为牛细胞中RNA编辑和转基因育种提供一种可靠的方法。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种牛源化CRISPR/boCas13a基因编辑系统、方法及应用。

背景技术

CRISPR-Cas系统是细菌抵御病毒入侵的一种免疫系统，经改造后，成为一种能够进行基因编辑的工具。其中最常用的是能够切割双链DNA的CRISPR-Cas9系统，可以针对几乎所有基因序列进行编辑。但在进行哺乳动物基因编辑的过程中，靶向切割DNA后，可能在很大程度上，会将突变后的基因遗传给后代，具有永久性和不可恢复性。与相对稳定遗传的DNA不同，RNA引起的改变是暂时的、非永久性的，CRISPR-Cas13系统具有RNA引导的RNA靶向性，是目前CRISPR-Cas家族中唯一仅靶向ssRNA的系统。在本实验室前期研究工作中发现，应用于牛细胞的CRISPR-Cas13编辑系统存在蛋白表达水平低、切割效率不足的问题。

在转基因研究过程中，常涉及到基因的异源表达，而异源物种的选择，是决定基因表达效率的重要因素。在真核生物中，共有61种三联体密码子编码20种氨基酸，每个氨基酸至少对应一种密码子，最多可以有一种氨基酸对应6种密码子，这种由多种密码子编码同一种氨基酸的密码子，称为同义密码子，同义密码子之间的差异主要在于第三位碱基的不同。在不同物种中，通常会出现对某些密码子的使用频率高于其他同义密码子的使用频率，这种现象称为密码子使用的偏好性。密码子优化是在DNA编码区进行偏好密码子的同义突变，来增加蛋白表达量。因此，在牛细胞中使用CRISPR/Cas13基因编辑系统时，需要对韦氏纤毛菌来源的Cas13a蛋白进行密码子偏好性优化，建立一套高效打靶的牛源性CRISPR/boCas13a系统，以为进一步研究基因组靶向修饰和转基因育种研究提供有效的技术手段。

发明内容

为此，本发明提供一种牛源化CRISPR/boCas13a基因编辑系统、方法及应用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种牛源化CRISPR/boCas13a基因编辑系统，包括boCas13a蛋白和crRNA；编码所述boCas13a蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.4-10中的任一种。

根据本发明实施例的第二方面，提供利用如上所述的牛源化CRISPR/boCas13a基因编辑系统进行基因编辑方法，包括如下步骤：

（1）分别构建boCas13a表达载体和crRNA表达载体；

（2）将所述boCas13a表达载体和crRNA表达载体共转染牛源细胞；

（3）对牛源细胞靶基因的切割效率进行检测。

进一步地，将所述boCas13a基因序列构建在pLWCas13a载体上，获得boCas13a表达载体。

进一步地，所述靶基因为MSTN、FTO、CD44、ACADSB、PRNP、LDLR或HEBP1。

进一步地，采用Real-Time qPCR法进行切割效率检测。

根据本发明的第二方面，提供如上所述的牛源化CRISPR/boCas13a基因编辑系统在编辑哺乳动物RNA及转基因育种方面中的应用。