[发明专利]牛源化CRISPR/boCas9基因编辑系统、方法及应用

说明书

本发明公开了一种牛源化CRISPR/boCas9基因编辑系统、方法及应用。一种牛源化CRISPR/boCas9基因编辑系统，包括boCas9蛋白和sgRNA；编码所述boCas9蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明根据牛细胞的密码子偏好性对外源Cas9基因进行优化，可以显著提高牛细胞中Cas9基因的转录和翻译效率，最终增加细胞中Cas9蛋白质的含量。结果显示：改造后的牛源化boCas9蛋白质表达量是野生型对照组Cas9的2倍，靶基因切割效率是野生型对照组的至少6倍。本发明方法能够有效提高CRISPR/boCas9基因编辑系统在牛细胞中的切割效率。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种牛源化CRISPR/boCas9基因编辑系统、方法及应用。

背景技术

CRISPR/Cas9系统是一种细菌与古生菌的获得性免疫系统，包括sgRNA和Cas9蛋白两个核心元件，sgRNA可以引导Cas9蛋白到达特定的靶标区域，Cas9具有核酸酶的作用，能够切割DNA双链。在所有的CRISPR/Cas9系统中，最常用的是从化脓链球菌中优化的SpCas9，SpCas9因拥有极简的PAM序列：5’-NGG-3’，可以针对几乎所有基因序列进行编辑，是目前使用最多的一种基因编辑技术。

生物体内的蛋白质由20种氨基酸组成，编码氨基酸的密码子有64种，每个氨基酸至少对应一种密码子。在不同生物中，蛋白质的密码子使用频率存在很大的差异，具有很大的偏好性，其中使用频率高的密码子称为最佳密码子，很少被利用的密码子称为稀有密码子。当外源基因的编码序列与靶向细胞的密码子偏好性越接近，外源基因的蛋白质翻译效率也越高。因此，在牛细胞中使用CRISPR/Cas9基因编辑系统时，对化脓链球菌来源的Cas9蛋白进行密码子偏好性优化，建立一套高效打靶的牛源性CRISPR/Cas9系统，为牛基因组靶向编辑和修饰生物育种研究提供了有效技术手段。

发明内容

为此，本发明提供一种牛源化CRISPR/boCas9基因编辑系统、方法及应用。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

根据本发明实施例的第一方面，提供一种牛源化CRISPR/boCas9基因编辑系统，包括boCas9蛋白和sgRNA；编码所述boCas9蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述sgRNA选自sgRNA1-5中任一种，其中，

sgRNA1的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，反义链的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；

sgRNA2的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，反义链的核苷酸序列如SEQID NO.5所示；

sgRNA3的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，反义链的核苷酸序列如SEQID NO.7所示；

sgRNA4的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，反义链的核苷酸序列如SEQID NO.9所示；

sgRNA5的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，反义链的核苷酸序列如SEQID NO.11所示。

根据本发明的第二方面，本发明利用如上所述的牛源化CRISPR/boCas9基因编辑系统进行基因编辑方法，包括如下步骤：

（1）分别构建boCas9表达载体和sgRNA表达载体；

（2）将所述boCas9表达载体和sgRNA表达载体共转染牛源细胞；

（3）对牛源细胞靶基因的切割效率进行检测。

进一步地，将所述boCas9基因序列构建在pSpCas9载体上，获得pboCas9表达载体。