[发明专利]一种提高鸭坦布苏病毒E蛋白亚单位疫苗免疫保护力的方法和应用

权利要求书

1.一种提高鸭坦布苏病毒E蛋白亚单位疫苗免疫保护力的方法，包括通过CHO细胞中mgat1基因敲弱，获得CHO-E-mgat1-KD重组细胞株，使MGAT1蛋白表达量下降进而提高鸭坦布苏病毒E蛋白N-糖基化修饰中的高甘露糖型的相对含量，提高在免疫DTMUV E蛋白亚单位疫苗后的免疫保护力。

2.根据权利要求1所述的提高鸭坦布苏病毒E蛋白亚单位疫苗免疫保护力的方法，其特征在于，通过脂质体转染方法将PX-sgRNA-mgat1质粒转染至鸭坦布苏病毒E蛋白的细胞株上，通过筛选获得mgat1基因敲弱的单克隆CHO-E-mgat1-KD重组细胞株；

其中，mgat1基因敲弱后，mgat1基因N端存在～200bp片段的缺失。

3.根据权利要求2所述的提高鸭坦布苏病毒E蛋白亚单位疫苗免疫保护力的方法，其特征在于，将含有所述mgat1基因敲弱的单克隆CHO-E-mgat1-KD重组细胞株表达的重组DTMUVE蛋白通过肌肉注射接种到樱谷鸭体内，免疫保护率提高50％。

4.根据权利要求1-3任一项所述的提高鸭坦布苏病毒E蛋白亚单位疫苗免疫保护力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.PX-sgRNA-mgat1质粒的抽提；

根据mgat1基因序列的关键点进行设计sgRNA，并将将含sgRNA的多聚双链寡核苷酸序列片段连接到含BbsI酶切位点的载体(PX)上，抽提得到所述PX-sgRNA-mgat1质粒；

S2.转染和筛选单克隆

通过脂质体转染方法将所述PX-sgRNA-mgat1质粒转染至鸭坦布苏E蛋白的细胞株上；通过阳性确认获取所述mgat1基因敲弱的单克隆CHO-E-mgat1-KD重组细胞株；

S3.免疫保护率评价

通过病毒分离法评价攻毒后疫苗免疫保护率。

5.根据权利要求4所述的提高鸭坦布苏病毒E蛋白亚单位疫苗免疫保护力的方法，其特征在于，S2中，所述含sgRNA的多聚双链寡核苷酸序列片段与所述含BbsI酶切位点的载体的质量比为1∶0.5～2；

所述脂质体转染方法中选用Neofect^TM非阳离子脂质体进行转染；转染后36～72小时后利用有限稀释法获的所述mgat1基因敲弱的单克隆CHO-E-mgat1-KD重组细胞株。

6.根据权利要求5所述的提高鸭坦布苏病毒E蛋白亚单位疫苗免疫保护力的方法，其特征在于，所述PX-sgRNA-mgat1质粒中，sgRNA根据mgat1基因序列进行设计，得到含sgRNA的多聚双链寡核苷酸序列，具体地，包括SEQ NO：1～SEQ NO：4四个序列：

SEQ NO：1 CACCGTCCAAGCAGACACACACCA

SEQ NO：2 AAACTTGGTGTGTGTCTGCTTGGAC

SEQ NO：3 CACCGGCCGTAAGGGTGTGAGCCA

SEQ NO：4 AAACTGGCTCACACCCTTACGGCC。

7.根据权利要求6所述的提高鸭坦布苏病毒E蛋白亚单位疫苗免疫保护力的方法，其特征在于，所述PX-sgRNA-mgat1质粒包括将含sgRNA的多聚双链寡核苷酸序列片段连接到含BbsI酶切位点的载体上，通过抽提得到所述PX-sgRNA-mgat1质粒。