[发明专利]一种提高鸭坦布苏病毒E蛋白亚单位疫苗免疫保护力的方法和应用

说明书

本发明提供了一种提高鸭坦布苏病毒E蛋白亚单位疫苗免疫保护率的方法，包括通过CHO细胞中mgatl基因敲弱，获得CHO‑E‑mgat1‑KD重组细胞株，使MGAT1蛋白表达量下降来提高鸭坦布苏病毒E蛋白N‑糖基化修饰中的高甘露糖型的相对含量，从而提高在免疫DTMUV E蛋白亚单位疫苗后的免疫保护力。采用本发明的技术方案，通过将CHO细胞中敲弱mgat1，提高DTMUV E蛋白中高甘露糖型相对含量提升显著，相比较未敲弱mgat1基因的疫苗组，免疫保护率提高50％以上。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种提高鸭坦布苏病毒E蛋白亚单位疫苗免疫保护力的方法和应用。

背景技术

鸭坦布苏病毒(Duck Tambusu virus，DTMUV)于2010年4月首次在浙江发现，该病以种鸭和蛋鸭的产蛋下降为主要临床症状，感染率为100％，死亡率在5～30％之间。DTMUV是具备囊膜的单股正链的RNA病毒，有一个开放阅读框(open reading frame，ORF)可转录翻译为和核衣壳蛋白C、囊膜蛋白E、膜前体蛋白prM三个结构蛋白和NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5七个非结构蛋白。基因组全长11kb左右，基因组结构为5′-UTR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-UTR-3′，基因组结构参阅如图1。

在缺乏高效且经济的治疗措施的背景下，疫苗接种是阻断DTMUV传染的主要方法。随着多种DTMUV疫苗的研发和临床应用，DTMUV的流行性质由多地暴发性变为地方流行性，疫苗接种在鸭群免DTMUV侵染方面具有良好效果。因此，需开发安全有效的疫苗以彻底阻DTMUV的传播，为养鸭业提供更为可靠的安全保障。针对DTMUV的国内批准的疫苗类型主要是减毒疫苗和灭活疫苗。DTMUV减毒疫苗的研制往往是将亲代病毒在鸭胚或鸡胚中连续传代以减小病毒毒力而实现的。减毒后的病毒没有丢失其免疫原性，能引起接种鸭群免疫应答从而产生特异性抗体，并提供有效保护。但减毒活疫苗本质为活疫苗具有潜在的毒性和毒力返祖的可能性，且需要较为严格的保存条件。DTMUV灭活疫苗的制备原理是利用理化方法对大量的病毒原液进行灭活，并搭配适当的佐剂制成。但灭活疫苗往往存在接种剂量大，持续免疫时间短，甚至免疫失效等局限性，需配合非免疫原性佐剂以增强机体免疫应答，从而达到完全免疫的效果。亚单位疫苗不同于传统的减毒疫苗和灭活疫苗，其具备更高的安全性，其直接利用体外合成的重组抗原蛋白来诱导宿主的抗病毒反应。理想的疫苗应能够刺激机体产生特异性的免疫反应，并能诱导长期持久的免疫记忆以保护机体免受疾病侵袭。作为一种成功的疫苗，其抗原可被抗原提呈细胞所提呈，并激活机体免疫系统引起抗原特异性免疫反应。

E蛋白是DTMUV主要抗原呈递区同时也是最大的结构糖蛋白，其在吸附、进入、病毒组装和抗原呈递中发挥重要作用，被作为基因工程疫苗的理想抗原在禽类疾病防治方面发挥重要的作用。树突状细胞(DC)是已知体内最强的专职抗原提呈细胞，其最大的特点是能够刺激初始细胞增殖和启动机体免疫反应。Glaffig M.等在ChemMedChem.2018，13(1)：25-29中指出蛋白或抗原甘露糖基化可以增强树突状(DC)细胞上甘露糖受体(MR)识别呈递抗原的效率，甘露糖基化的抗原大大增强了DC识别并结合抗原的能力。目前对于治疗蛋白和抗体的甘露糖基化或偶联主要应用于目标药物(治疗性蛋白/抗体)靶向甘露糖受体阳性巨噬细胞和树突状细胞来改善抗原摄取和呈递。昆虫细胞杆状病毒表达系统的N-糖基化修饰过程更为简单几乎终止于核心五碳糖，以高和低甘露糖型为主，相较于CHO细胞表达系统比昆虫细胞杆状病毒表达系统表达的E蛋白免疫效果更佳，所需剂量更少，很可能因E蛋白高甘露糖化具备更佳的抗原呈递效果。