[发明专利]一种竹针孢座囊菌及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种竹针孢座囊菌(Aciculosporium take)，其特征在于，所述竹针孢座囊菌在2023年03月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC No.M 2023413。

2.一种如权利要求1所述的竹针孢座囊菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)候选基因左右同源臂克隆

提取Aciculosporium take真菌基因组DNA，扩增候选基因左右同源臂A、B臂片段；

(2)敲除载体的构建

a带有适于真菌基因表达的构巢曲霉启动子PtrpC及增强绿色荧光EGFP能够高效表达绿色荧光基因的重组载体pCAMBIA1300ura-EGFP-BAR的构建：利用pCAMBIA1300ura-GFP-BAR起始载体质粒为模板克隆启动子pTrpc基因序列，pEGFP-N1载体质粒为模板扩增并克隆绿色强荧光蛋白EGFP基因序列；将起始载体质粒pCAMBIA1300ura-GFP-BAR通过限制性内切酶AvrⅡ和BamHⅠ进行双酶切线性化，将启动子pTrpc、绿色强荧光蛋白EGFP与pCAMBIA1300ura-GFP-BAR连接与转化；

b敲除载体pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B的构建：根据A、B、HYG序列及pCAMBIA1300ura-EGFP-BAR序列，设计A、B、HYG含融合PCR接头且能使片段与线性化克隆载体相互同源重组的序列；以A、HYG、B克隆质粒DNA为模板，使用ApexHF HSDNA聚合酶-FS高保真酶扩增长度2832bp的融合片段；将pCAMBIA1300ura-EGFP-BAR重组载体线性化形成粘性末端，将A-HYG-B融合片段与pCAMBIA1300ura-EGFP-BAR质粒连接与转化，构建敲除载体pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B；

(3)农杆菌介导敲除载体转化Aciculosporium take野生型菌株

a将pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B敲除载体质粒转化至农杆菌AGL1感受态细胞；

b Aciculosporium take野生菌株对潮霉素抗生素的敏感性实验：制备含不同浓度潮霉素的培养基，观察Aciculosporium take野生菌株的生长状况，选择完全抑制浓度作为筛选转化子最佳条件；

c含载体的农杆菌与Aciculosporium take野生型菌株共培养转化：利用农杆菌介导技术将基因敲除片段pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B转化至Aciculosporium take野生型菌株；

d对筛选平板上转化子进行PCR验证及荧光观察验证。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述扩增候选基因左右同源臂片段的引物包括扩增A臂的引物和扩增B臂的引物。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述扩增A臂的引物包括如SEQ IDNO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述扩增B臂的引物包括如SEQ IDNO.3所示的上游引物和如SEQ ID NO.4所示的下游引物。

6.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的竹针孢座囊菌。

7.如权利要求1所述竹针孢座囊菌在研究竹丛枝病菌与寄主互作机理中的应用。

8.如权利要求6所述菌剂在制备防治丛枝病药剂中的应用。