[发明专利]一种竹针孢座囊菌及其制备方法与应用

说明书

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种竹针孢座囊菌及其制备方法与应用。针对目前关于竹针孢座囊菌研究在基因分子层面的空缺，提供了一种带有适于真菌基因表达的构巢曲霉启动子(PtrpC)及增强绿色荧光(EGFP)能够高效表达绿色荧光基因的敲除载体质粒在竹针孢座囊菌基因敲除中的应用。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种竹针孢座囊菌及其制备方法与应用。

背景技术

丛枝病(Witche’s broom disease，WBD)作为对竹林危害最严重的病害之一，在发病严重的竹林中，常造成整个竹林衰败，对生态环境影响严重，造成巨大经济损失，并严重威胁大熊猫等食竹动物生存。引起竹丛枝病的病原大多为真菌，而我国普遍发生的竹丛枝病是由竹针孢座囊菌(Aciculosporium take)引起，竹针孢座囊菌目前研究仅限于病原鉴定、菌种生长条件初探、外部形态观测和少量生理生化指标检测上，远远不能解析竹丛枝病的发病机理，通过基因分子层面改造对竹针孢座囊菌的代谢进行调控以探究竹丛枝病发病机理还未见有报道。

发明内容

本发明提供了一种竹针孢座囊菌(Aciculosporium take)，所述竹针孢座囊菌在2023年03月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC No.M 2023413。

本发明还提供了上述菌种的构建方法，包括以下步骤：

(1)候选基因左右同源臂克隆

提取Aciculosporium take真菌基因组DNA，扩增候选基因左右同源臂A、B臂片段；

(2)敲除载体的构建

a带有适于真菌基因表达的构巢曲霉启动子PtrpC及增强绿色荧光EGFP能够高效表达绿色荧光基因的重组载体

pCAMBIA1300ura-EGFP-BAR的构建：利用pCAMBIA1300ura-GFP-BAR起始载体质粒为模板克隆启动子pTrpc基因序列，pEGFP-N1载体质粒为模板扩增并克隆绿色强荧光蛋白EGFP基因序列；将起始载体质粒pCAMBIA1300ura-GFP-BAR通过限制性内切酶AvrⅡ和BamHⅠ进行双酶切线性化，将启动子pTrpc、绿色强荧光蛋白EGFP与pCAMBIA1300ura-GFP-BAR连接与转化；

b敲除载体pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B的构建：根据A、B、HYG序列及pCAMBIA1300ura-EGFP-BAR序列，设计A、B、HYG含融合PCR接头且能使片段与线性化克隆载体相互同源重组的序列；以A、HYG、B克隆质粒DNA为模板，使用ApexHF HS DNA聚合酶-FS高保真酶扩增长度2832bp的融合片段；将pCAMBIA1300ura-EGFP-BAR重组载体线性化形成粘性末端，将A-HYG-B融合片段与

pCAMBIA1300ura-EGFP-BAR质粒连接与转化，构建敲除载体pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B；

(3)农杆菌介导敲除载体转化Aciculosporium take野生型菌株

a将pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B敲除载体质粒转化至农杆菌AGL1感受态细胞；

b Aciculosporium take野生菌株对潮霉素抗生素的敏感性实验：制备含不同浓度潮霉素的培养基，观察Aciculosporium take野生菌株的生长状况，选择完全抑制浓度作为筛选转化子最佳条件；

c含载体的农杆菌与Aciculosporium take野生型菌株共培养转化：利用农杆菌介导技术将基因敲除片段pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B转化至Aciculosporium take野生型菌株；