[发明专利]用于甲状腺癌检测的数字PCR试剂盒

说明书

本发明提供一种用于甲状腺癌检测的数字PCR试剂盒，所述数字PCR试剂盒用于同时检测TERT‑C250T、TERT‑C228T和BRAF V600E突变，所述试剂盒中缓冲体系包括Tris‑HCl、甘油、dNTPs、KCl、MgClsubgt;2/subgt;、Taq DNA聚合酶、UNG酶、甜菜碱和甲酰胺，所述甜菜碱终浓度为0.4~0.6M，所述甲酰胺体积浓度为0.5%‑2%和所述Taq DNA聚合酶终浓度为3U以上。本发明通过检测体系中各组分终浓度的优化，实现了在复杂基因组背景下的靶标序列的检测灵敏度可达到0.2%。

技术领域

本发明涉及数字PCR检测领域，特别涉及用于甲状腺癌检测的数字PCR试剂盒。

背景技术

目前鉴别甲状腺结节良恶性最常见的检查方式是甲状腺B超，但是受到B超医生经验、水平等主观因素影响较大，阳性率在30~80%不等。如果B超检查提示结节存在恶性的可能，就需要进行穿刺活检，根据是否观察到肿瘤细胞，判断结节的良恶性。

穿刺病理是诊断甲状腺结节良恶性的金标准，但是由于结节穿刺细胞数量有限，并且受到涂片的影响，穿刺病理的诊断对病理医生要求很高。即使是国际上最好的甲状腺病理诊断实验室，也有20~40%穿刺成功的结节不能判断良恶性。

随着分子生物学的发展，甲状腺癌的特异性分子标志物不断被发现，因此通过细胞病理联合分子诊断可以显著增加恶性结节的确诊率。

BRAF和TERT基因是甲状腺癌诊断和预后判定方面非常重要的两个基因，其中BRAF基因是一种致癌基因，编码一种丝/苏氨酸特异性激酶，参与调控细胞内多种生理功能，如细胞生长、分化和凋亡等。BRAF基因在亚洲人群甲状腺癌中突变率非常高，大概在80%左右。在诊断方面，对于穿刺的细胞意义不明确的III、IV类的患者中，BRAF基因检测可使我们对甲状腺癌术前诊断的准确率达到95%以上。因此，BRAF基因为甲状腺癌的诊断提供了一个非常好的分子学辅助诊断的指标。

TERT基因是一个判定预后和复发的指标。主要突变位点为TERT基因启动子的C228T和C250T突变。在甲状腺癌的诊断过程中，如果发现TERT基因发生突变，就预示着患者预后会比较差，尤其是一些低分化的甲状腺乳头状癌。如果同时存在TERT突变和BRAF突变，即双重突变的患者，说明该肿瘤可能侵袭性比较强，复发转移概率比没有基因突变的患者更高，所以在手术方案的选择上，就倾向于更大范围的手术方案，以保证手术彻底性，并且术后要密切随访观察，其预后会更差。TERT和BRAF基因检测为术前判定甲状腺癌患者的良恶性和预后提供了分子基础。在广泛的甲状腺肿瘤患者中都有非常普遍的检测意义，今后在各个地区和医院将会很广泛的开展这两个基因的检测。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种用于甲状腺癌检测的数字PCR试剂盒，所述数字PCR试剂盒用于同时检测TERT-C250T、TERT-C228T和BRAF V600E突变，所述试剂盒中缓冲体系包括Tris-HCl、甘油、dNTPs、KCl、MgCl2、Taq DNA聚合酶、UNG酶、甜菜碱和甲酰胺，所述甜菜碱终浓度为0.4~0.6M，所述甲酰胺终体积浓度为0.5%-2%和所述Taq DNA聚合酶终浓度为3U以上。

在一种实施方式中，所述Taq DNA聚合酶终浓度为3~4U。

在一种实施方式中，所述Tris-HCl终浓度为0.04-0.05M。

在一种实施方式中，所述甘油终体积浓度为4-8%。

在一种实施方式中，所述dNTPs中dATP:dUTP、dCTP:dUTP、dGTP:dUTP的物质量比例都为1:2到1:3之间。

在一种实施方式中，所述KCl终浓度为20-50mM。

在一种实施方式中，所述UNG酶终浓度为0.2U以上。

在一种实施方式中，所述UNG酶终浓度为0.2-0.4U以。