[发明专利]一种利用长引物快速从头合成目的片段的方法

权利要求书

1.一种利用长引物快速从头合成目的片段的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)设计合成存在碱基重叠、覆盖整个目的片段的长引物；所述长引物的序列长度为80～100nt，优选为80～90nt，进一步优选为90nt；

(2)使用偶数条步骤(1)获得的长引物交替重叠延伸进行PCR扩增，获得PCR产物；

(3)利用一步法同源重组将步骤(2)获得的PCR产物直接整合到线性化载体中，得到重组产物；

(4)将步骤(3)获得的重组产物转化入感受态细胞，获得带有目的基因的转化子；

所述步骤(1)～步骤(3)总耗时2～5h。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中退火温度为45℃以上。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)中，所述碱基重叠的重叠长度为18～25bp，优选为18～22bp，进一步优选为20bp。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR采用无模板模式，以偶数条步骤(1)所得长引物中重叠交替延伸时最外侧的两条引物作为正/反向外引物，剩余最大偶数条的长引物作为内引物。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR的体系由0.5μl终浓度为10nM内引物混合液、1μl终浓度为0.2μM正向外引物、1μl终浓度为0.2μM反向外引物、25μl高保真DNA聚合酶、dNTP以及缓冲液的混合体系，ddH₂O补足至50μl组成的；优选地，所述终浓度为10nM内引物混合液为所述内引物均以10nM的浓度等体积混匀后获得。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)中，所述线性化载体是通过PCR技术利用含有同源臂的引物使载体线性化得到的。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)中，所述一步法同源重组，其体系包括线性化载体和n个插入片段，5≥n≥1。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述的线性化载体和插入片段的摩尔比是1:1，终浓度为0.03pmol的每个线性化载体/插入片段使用量＝[0.02×线性化载体/插入片段碱基对数]ng。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)中，所述一步法同源重组，其重组时间为30min，重组温度为37℃。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)中，待重组时间结束后置于4℃保存。