[发明专利]一种利用长引物快速从头合成目的片段的方法

说明书

本发明公开了一种利用长引物快速从头合成目的片段的方法，包括如下步骤：(1)设计合成多条存在碱基重叠、覆盖整个目的片段的长引物；(2)使用偶数条步骤(1)获得的长引物交替重叠延伸进行PCR扩增，获得PCR产物；(3)利用一步法同源重组将步骤(2)获得的PCR产物直接整合到线性化载体中，得到重组产物；(4)将步骤(3)获得的重组产物转化入感受态细胞，获得带有目的基因的转化子；所述方法从目的基因中长引物的设计到最终产品耗时2～5h。本发明所提供的方法适用于长片段DNA快速合成，具有合成周期短，正确率高的特点，适用于具有高G+C含量、重复序列或复杂的二级结构的DNA合成。

技术领域

本发明属于合成生物学领域，具体涉及一种利用长引物快速从头合成目的片段的方法(Rapid DNA synthesis using long primers,RSLP)。

背景技术

DNA序列的化学合成为异源系统中的基因的高效表达以及基因结构功能的表征提供了一种强大的工具。然而，由于模板DNA并不总是很容易获得，化学合成使得在不使用模板DNA分子的情况下产生基因成为可能。然而基因化学合成法也存在许多缺点，包括价格高昂、合成周期长、难以合成高G+C含量、重复序列或复杂的二级结构的DNA。所以，为了避免实验周期因为目标DNA合成而变得过长，开发一种DNA简便、快速且经济的合成方法变得十分重要。

近年来，有些研究描述了一些基于寡核苷酸的DNA序列合成和组装方法，如基于PCR的热力学平衡由内而外合成法(TBIO)、基于双不对称性PCR两步基因合成法((DA-PCR)、重叠延伸PCR(OE-PCR)、PCR两步合成DNA法(PTDS)和基于PCR的精确合成(PAS)等等。然而，这些技术存在着明显的缺陷，例如PCR合成的错误率相对较高、PCR体系冗余、PCR程序繁琐等。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用长引物快速从头合成目的片段的方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种利用长引物快速从头合成目的片段的方法，即用于合成长而准确的DNA序列的PTDS方法的改进版本RSLP。与其他DNA PCR合成方法类似，RSLP协议的第一步是设计要合成的DNA序列；在此步骤中可以优化密码子和G+C含量，以及不良的限制酶位点或二级结构；根据DNA序列，设计并化学合成与相邻的寡核苷酸重叠约18～25bp的80～100nt寡核苷酸，即长引物。然后第二步，采用前述寡核苷酸组使用PCR产生长度约为500～1000bp的小片段DNA(图1)。此处，为了节省时间，在进行PCR的步骤时将多组体系(合成同一基因不同片段)同时进行(选取最小Tm值作为退火温度)。其中，每组中最外侧的两条引物作为正/反向外引物，使用剩余的最大偶数条内部寡核苷酸作为内引物；此步骤应使用高保真DNA聚合酶。最后第三步，将多组小片段DNA(500～1000bp)通过infusion一步克隆的方式直接组装到基因表达载体上进行基因表征(图2)。

所述利用长引物快速从头合成目的片段的方法具体包括如下步骤：

(1)设计合成多条存在碱基重叠、覆盖整个目的片段的长引物；

(2)使用偶数条步骤(1)获得的长引物交替重叠延伸进行PCR扩增，获得PCR产物，即长度约为500～1000bp的小片段DNA；

(3)利用一步法同源重组将步骤(2)获得的PCR产物直接整合到线性化载体中，得到重组产物；

(4)将步骤(3)获得的重组产物转化入感受态细胞，获得带有目的基因的转化子；

所述方法从目的基因中长引物的设计到最终产品，即步骤(1)～(3)总耗时2～5h。

上述方法中，若涉及退火，其温度为45℃以上，如所涉及PCR过程中，退火的温度为45℃以上，多引物PCR程序，以及载体片段线性化PCR程序中，退火的温度均为45℃以上。