[发明专利]一种蛋白质纯化的方法

权利要求书

1.一种蛋白质纯化的方法，其特征在于：

1)通过RF克隆，将目的基因(可编码目的融合蛋白)与MiSBM标签基因(可编码标签蛋白MiSBM)插入表达载体中，构建重组质粒；重组质粒中目的基因GFP与标签蛋白MiSBM间通过MxeGyrA-linker连接；

2)将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)的热击感受态细胞中，筛选出阳性克隆，得到重组菌株；

3)将筛选出的重组质粒的菌株进行培养，并进行目的融合蛋白的诱导表达；

收集菌体，破碎后分离，收集含有目的融合蛋白的上清液；

4)将上清液与由质量比为(1:1-1:4，优选1：1-2)的黄原胶与聚乙烯醇组成的填料接触，室温结合1-24h，优选1-2h；

5)采用0.7mM-1.0mM NaCl(优选0.8-0.9mM)溶液，可将蛋白从黄原胶基填料上洗脱纯化，得到纯化产物；

或，采用MxeGyrA-linker断裂反应液，将目的融合蛋白与标签蛋白MiSBM切割，从黄原胶基填料上分离下来目的融合蛋白，得到纯化产物。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

质量比为(1:1-1:4)的黄原胶与聚乙烯醇组成的填料的制备过程，包括以下步骤：

S1：将聚乙烯醇溶解在70-100℃的热水中，冷却至室温后，加入黄原胶搅拌5-16h，得到均匀的无气泡溶液，作为水相；

黄原胶与聚乙烯醇质量比为(1:1-1:4)(优选1：1-2)；且水相中总聚合物(聚乙烯醇与黄原胶质量之和)浓度为1-4％(优选4％)，w/v，g/mL；

S2：将油相和乳化剂加入水相中，用搅拌器以800rpm/min-5000rpm/min搅拌40min-4h；

油相为液体石蜡、甲苯、环己烷中的一种或二种以上，乳化剂为1-8％(优选8％)w/w(占油相)span 80；水相在体系中的体积(1-40％，优选30％)；

S3：缓慢加入4×10^-6-4×10^-4％(占体系体积)戊二醛，及1-2mL 1-2M硫酸，继续以800rpm/min-5000rpm/min搅拌40min-4h；

S4：用80-95℃热乙醇洗涤，去除油相，得到黄原胶微球；

或，用溶剂和蒸馏水分别洗涤，去除油相；然后将制备的微球在室温～50℃(优选25℃)下干燥1-24h(优选1h)，得到黄原胶微球；

所述清洗微球的溶剂可选择苯、乙醚、氯仿、二硫化碳中的一种或二种以上。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

表达载体可为下述载体中的一种或二种以上，

pColdⅡ大肠杆菌表达载体、pET-21a(+)大肠杆菌表达载体、pET-22b(+)大肠杆菌表达载体、pET-24a(+)大肠杆菌表达载体、pET-28a(+)大肠杆菌表达载体、pET-30a(+)大肠杆菌表达载体、pET-32a(+)大肠杆菌表达载体。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

大肠杆菌BL21(DE3)可采用如下所述菌中的一种或二种以上替代；Rosetta(DE3)、T7Express、BLR(DE3)、Tuner(DE3)、Lemo21(DE3)。