[发明专利]一种蛋白质纯化的方法在审
申请号: | 202310535780.9 | 申请日: | 2023-05-12 |
公开(公告)号: | CN116375887A | 公开(公告)日: | 2023-07-04 |
发明(设计)人: | 刘胜雨;赵小雅;杨帆;俞志敏;李宪臻 | 申请(专利权)人: | 李宪臻 |
主分类号: | C07K19/00 | 分类号: | C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C07K1/22 |
代理公司: | 沈阳科苑专利商标代理有限公司 21002 | 代理人: | 马驰 |
地址: | 116000 辽*** | 国省代码: | 辽宁;21 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 蛋白质 纯化 方法 | ||
1.一种蛋白质纯化的方法,其特征在于:
1)通过RF克隆,将目的基因(可编码目的融合蛋白)与MiSBM标签基因(可编码标签蛋白MiSBM)插入表达载体中,构建重组质粒;重组质粒中目的基因GFP与标签蛋白MiSBM间通过MxeGyrA-linker连接;
2)将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)的热击感受态细胞中,筛选出阳性克隆,得到重组菌株;
3)将筛选出的重组质粒的菌株进行培养,并进行目的融合蛋白的诱导表达;
收集菌体,破碎后分离,收集含有目的融合蛋白的上清液;
4)将上清液与由质量比为(1:1-1:4,优选1:1-2)的黄原胶与聚乙烯醇组成的填料接触,室温结合1-24h,优选1-2h;
5)采用0.7mM-1.0mM NaCl(优选0.8-0.9mM)溶液,可将蛋白从黄原胶基填料上洗脱纯化,得到纯化产物;
或,采用MxeGyrA-linker断裂反应液,将目的融合蛋白与标签蛋白MiSBM切割,从黄原胶基填料上分离下来目的融合蛋白,得到纯化产物。
2.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:
质量比为(1:1-1:4)的黄原胶与聚乙烯醇组成的填料的制备过程,包括以下步骤:
S1:将聚乙烯醇溶解在70-100℃的热水中,冷却至室温后,加入黄原胶搅拌5-16h,得到均匀的无气泡溶液,作为水相;
黄原胶与聚乙烯醇质量比为(1:1-1:4)(优选1:1-2);且水相中总聚合物(聚乙烯醇与黄原胶质量之和)浓度为1-4%(优选4%),w/v,g/mL;
S2:将油相和乳化剂加入水相中,用搅拌器以800rpm/min-5000rpm/min搅拌40min-4h;
油相为液体石蜡、甲苯、环己烷中的一种或二种以上,乳化剂为1-8%(优选8%)w/w(占油相)span 80;水相在体系中的体积(1-40%,优选30%);
S3:缓慢加入4×10-6-4×10-4%(占体系体积)戊二醛,及1-2mL 1-2M硫酸,继续以800rpm/min-5000rpm/min搅拌40min-4h;
S4:用80-95℃热乙醇洗涤,去除油相,得到黄原胶微球;
或,用溶剂和蒸馏水分别洗涤,去除油相;然后将制备的微球在室温~50℃(优选25℃)下干燥1-24h(优选1h),得到黄原胶微球;
所述清洗微球的溶剂可选择苯、乙醚、氯仿、二硫化碳中的一种或二种以上。
3.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:
表达载体可为下述载体中的一种或二种以上,
pColdⅡ大肠杆菌表达载体、pET-21a(+)大肠杆菌表达载体、pET-22b(+)大肠杆菌表达载体、pET-24a(+)大肠杆菌表达载体、pET-28a(+)大肠杆菌表达载体、pET-30a(+)大肠杆菌表达载体、pET-32a(+)大肠杆菌表达载体。
4.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:
大肠杆菌BL21(DE3)可采用如下所述菌中的一种或二种以上替代;Rosetta(DE3)、T7Express、BLR(DE3)、Tuner(DE3)、Lemo21(DE3)。
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