[发明专利]一种蛋白质纯化的方法在审

专利信息
申请号: 202310535780.9 申请日: 2023-05-12
公开(公告)号: CN116375887A 公开(公告)日: 2023-07-04
发明(设计)人: 刘胜雨;赵小雅;杨帆;俞志敏;李宪臻 申请(专利权)人: 李宪臻
主分类号: C07K19/00 分类号: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C07K1/22
代理公司: 沈阳科苑专利商标代理有限公司 21002 代理人: 马驰
地址: 116000 辽*** 国省代码: 辽宁;21
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摘要:
搜索关键词: 一种 蛋白质 纯化 方法
【权利要求书】:

1.一种蛋白质纯化的方法,其特征在于:

1)通过RF克隆,将目的基因(可编码目的融合蛋白)与MiSBM标签基因(可编码标签蛋白MiSBM)插入表达载体中,构建重组质粒;重组质粒中目的基因GFP与标签蛋白MiSBM间通过MxeGyrA-linker连接;

2)将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)的热击感受态细胞中,筛选出阳性克隆,得到重组菌株;

3)将筛选出的重组质粒的菌株进行培养,并进行目的融合蛋白的诱导表达;

收集菌体,破碎后分离,收集含有目的融合蛋白的上清液;

4)将上清液与由质量比为(1:1-1:4,优选1:1-2)的黄原胶与聚乙烯醇组成的填料接触,室温结合1-24h,优选1-2h;

5)采用0.7mM-1.0mM NaCl(优选0.8-0.9mM)溶液,可将蛋白从黄原胶基填料上洗脱纯化,得到纯化产物;

或,采用MxeGyrA-linker断裂反应液,将目的融合蛋白与标签蛋白MiSBM切割,从黄原胶基填料上分离下来目的融合蛋白,得到纯化产物。

2.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:

质量比为(1:1-1:4)的黄原胶与聚乙烯醇组成的填料的制备过程,包括以下步骤:

S1:将聚乙烯醇溶解在70-100℃的热水中,冷却至室温后,加入黄原胶搅拌5-16h,得到均匀的无气泡溶液,作为水相;

黄原胶与聚乙烯醇质量比为(1:1-1:4)(优选1:1-2);且水相中总聚合物(聚乙烯醇与黄原胶质量之和)浓度为1-4%(优选4%),w/v,g/mL;

S2:将油相和乳化剂加入水相中,用搅拌器以800rpm/min-5000rpm/min搅拌40min-4h;

油相为液体石蜡、甲苯、环己烷中的一种或二种以上,乳化剂为1-8%(优选8%)w/w(占油相)span 80;水相在体系中的体积(1-40%,优选30%);

S3:缓慢加入4×10-6-4×10-4%(占体系体积)戊二醛,及1-2mL 1-2M硫酸,继续以800rpm/min-5000rpm/min搅拌40min-4h;

S4:用80-95℃热乙醇洗涤,去除油相,得到黄原胶微球;

或,用溶剂和蒸馏水分别洗涤,去除油相;然后将制备的微球在室温~50℃(优选25℃)下干燥1-24h(优选1h),得到黄原胶微球;

所述清洗微球的溶剂可选择苯、乙醚、氯仿、二硫化碳中的一种或二种以上。

3.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:

表达载体可为下述载体中的一种或二种以上,

pColdⅡ大肠杆菌表达载体、pET-21a(+)大肠杆菌表达载体、pET-22b(+)大肠杆菌表达载体、pET-24a(+)大肠杆菌表达载体、pET-28a(+)大肠杆菌表达载体、pET-30a(+)大肠杆菌表达载体、pET-32a(+)大肠杆菌表达载体。

4.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:

大肠杆菌BL21(DE3)可采用如下所述菌中的一种或二种以上替代;Rosetta(DE3)、T7Express、BLR(DE3)、Tuner(DE3)、Lemo21(DE3)。

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