[发明专利]一种蛋白质纯化的方法

说明书

本发明涉及蛋白质分离纯化技术领域,尤其涉及一种蛋白质纯化的方法，1)通过RF克隆，将目的基因与MiSBM标签基因插入表达载体中，构建重组质粒；2)将重组质粒转化至大肠杆菌中，筛选出阳性克隆，得到重组菌株；3)将筛选出的重组质粒的菌株进行培养，并进行目的融合蛋白的诱导表达；收集菌体，破碎后分离，收集含有目的融合蛋白的上清液；4)将上清液与由黄原胶与聚乙烯醇组成的填料接触；5)采用NaCl(优选溶液，可将蛋白从黄原胶基填料上洗脱纯化，得到纯化产物；或，采用MxeGyrA‑linker断裂反应液，将目的融合蛋白从黄原胶基填料上分离下来，得到纯化产物。

技术领域

本发明涉及蛋白质分离纯化技术领域,尤其涉及一种黄原胶微球的制备方法及高效、高特异性蛋白质纯化系统的建立。

背景技术

蛋白质是生命的体现者，几乎所有生命现象都与蛋白质结构、功能的正常体现密切相关，市场上绝大部分药物的作用靶点也都是通过蛋白质发挥作用。运用基因重组技术生产重组蛋白研究蛋白质结构与功能的技术已较为成熟。但处于重组蛋白表达下游处理阶段的蛋白质的分离纯化技术仍为蛋白质研究应用中的瓶颈问题，因蛋白质存在于较为复杂的混合体中，其自身稳定性较差，不易于分离，在蛋白质的纯化工艺中，追求重组蛋白的高产量，高纯度，探求更加高效低廉，高通量的纯化技术是研究者致力的目标。

蛋白质进一步纯化方法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析等，其通常需要较高成本，而亲和层析法相对高效，该领域的主要进展之一是发现了融合伙伴(简称“标签”)，它可以是蛋白质结构域、小肽甚至是融合在目标蛋白质N端或C端的酶，以增强其表达、溶解度(即正确折叠)和纯化。融合标记的使用是目前最强大的策略之一，以获得大规模的高产量和纯度的重组蛋白，独立于使用的宿主表达系统。

标签介导的重组蛋白纯化存在一些瓶颈问题，如填料(如琼脂糖)价格昂贵、纯化效率低、配基制备困难，配基本身需要分离纯化，配基与载体偶联条件苛刻等缺陷，标签蛋白过大、机械强度低、稳定性差等问题。Soto-Rodríguez等提出12个氨基酸的Car9标签与造价昂贵的二氧化硅有亲和力结合。Olmez等发现19-氨基酸R5双功能标签显示了硅结合亲和力和二氧化硅沉淀活性，但纯化效率较低。Kinrade等发现22.5KDa的mhpa14标签对以葡聚糖为基础的尺寸排除色谱树脂具有亲和力。故亲和层析技术仍需要更深入的优化与发展。

黄原胶(XG)是一种价格低廉，性能优良的生物高分子酸性杂多糖，含有纤维素骨架和三糖侧链，是集增稠、悬浮、乳化、稳定于一体，性能较为优越的生物胶。以其为原料所制备的水凝胶亲水性强、无毒、可降解、生物相容性好，常作高吸水性树脂、药物载体和微胶囊等，在生物领域具有广阔的应用前景。

SBM是项目团队从黄原胶降解菌Microbacterium sp.XT11中分离纯化出的一种新型黄原胶裂解酶MiXly中C端无催化活性的黄原胶结合模块，能够特异性识别并结合黄原胶侧链中的葡萄糖醛酸-甘露糖支链，同时项目团队对黄原胶降解菌Microbacteriumsp.XT11进行了全基因测序，并对黄原胶生物降解基因簇的与识别元件进行挖掘，已获得黄原胶结合模块MiSBM的基因序列((MiSBM基因序列已申请专利《一种特异性识别黄原胶侧链的碳水化合物结合模块CBM6B蛋白质及应用的制作方法》，专利申请号：CN202011356407.X，公开号：CN112481282A)，具备将其作为标签蛋白与目的基因融合并构建新型重组蛋白纯化系统的理论基础。可利用MiSBM与黄原胶的高亲和力和高结合特异性，采用聚乙烯醇交联黄原胶作为亲和填料，拟实现亲和层析法分离纯化带有MiSBM标签的目标蛋白质。

发明内容

为了实现上述目的，解决标签介导的重组蛋白纯化存在的一些瓶颈问题。