[发明专利]一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法

说明书

本发明公开了一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，本发明涉及细胞谱系追踪技术领域，具体包括以下步骤：选取序列完全不同的单向RNA1、单向RNA2、单向RNA3和单向RNA4备用，选取单细胞克隆扩增制备具有13个编辑位点的谱系条形码备用；采用细胞谱系条形码技术对单向RNA1、单向RNA2、单向RNA3和单向RNA4分别与谱系条形码的13个编辑位点匹配。该高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，增加谱系条形码在所有细胞中的平均表达量，降低了编辑位点被消耗的速度，增加了可追踪时间，同时降低了跨位点缺失突变的比例，获得的细胞谱系树单个叶子的比例高，实现了分辨率为单个细胞级别的谱系树测定方法，降低克隆扩增中细胞的死亡率，以及细胞消化中的损失率。

技术领域

本发明涉及细胞谱系追踪技术领域，具体为一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法。

背景技术

追踪细胞间表型差异及进化趋势，是细胞生物学和演化生物学的基本目标之一。高通量单细胞测序的最新进展，已经使得我们能从百万个单细胞的级别描述人正常组织和肿瘤/癌症的全转录组图谱。从演化生物学的角度重新进行思考，依赖于基因表达差异比较分析得到的是细胞类型之间的相似性，而不能代表细胞有丝分裂的历史，将生物群体演化思想的“物种演化树”进一步拓展到细胞群体演化的“细胞谱系树”方法，则能够将细胞间的有丝分裂关系对应到全转录组图谱，并实现基因表达差异和有丝分裂历史间的详细比较，因而，能准确的揭示生命过程中一般规律和模式的有力武器，是细胞谱系树技术，而非单纯的单细胞全转录组图谱技术。

基于追踪细胞间有丝分裂历史而建立的细胞谱系树技术第一次在线虫中成功测定，距今已有40年左右。细胞谱系树技术发展至今，大致可以分为两类：依据光学显微镜的分析方法，依据DNA谱系条形码测序结果重构的分析方法。光学显微镜分析方法主要包括：直接观察记录绘图的方法、基于示踪染料(活体示踪染料和右旋糖酐/碳菁染料)标记的方法，基于荧光显微镜的Brainbow系列等。这类技术的优势主要是观察结果直观，但缺点也较为明显，如分辨率较低，难以对非透明的组织进行直接观察等。依据DNA谱系条形码测序结果重构的分析方法，则不受组织/胚胎透明度的限制，且由于DNA条形码的多样性非常高，故而分辨率通常远超前者。DNA条形码技术又可以分为两类：不依赖DNA突变的Clonalbarcode技术和依赖DNA突变的Lineage barcode技术。Clonal barcode技术主要应用于高通量的追踪单个祖细胞的增殖速率或分化命运，而不关心其后代细胞之间的谱系关系。Lineage barcode技术应用于追踪同一起源的后代细胞之间的谱系关系，其中较成功的是基于CRISPR/Cas9随机插入和缺失突变的GESTALT、CARLIN技术等。虽然Clonal barcode和Lineage barcode技术相结合，成功在肺癌细胞增殖和转移过程中实现了高通量追踪单细胞级别的细胞谱系关系图谱，然而过低的分辨率/覆盖度使得该数据不足以应用树的比对方法(排除共同祖先对子细胞间基因表达相关性及表型相关性的影响)来进行基因表达差异和有丝分裂历史的详细比较。

根据上述说明，现有技术谱系树的精度及对原始细胞群体的覆盖度均较低，对整个细胞群体的有丝分裂历史的追踪存在较大程度的缺失，其导致原因为：用于测序的细胞数量太少，降低谱系树对细胞群体的覆盖度；用于谱系追踪的lineage barcode表达量过低，在单细胞测序中丢失，进一步降低了谱系树的覆盖度；大部分lineage barcode含有跨越编辑位点的长缺失突变，这将降低可以继续编辑的位点数目，并可能剪掉已经发生的编辑事件，降低了谱系树的精度；大部分位点通常在2-4天内被编辑完毕，谱系追踪时间过短；lineage barcode的大部分基因型均存在于多个细胞中，无法区分，这限制了依赖树的单细胞表达差异比较。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，解决了现有技术谱系树的精度及对原始细胞群体的覆盖度均较低，对整个细胞群体的有丝分裂历史的追踪存在较大程度的缺失问题。

(二)技术方案