[发明专利]一种从卵黄抗体IgY中分离Fab和Fc片段的方法

说明书

本发明提供了一种从卵黄抗体IgY中分离Fab和Fc片段的方法，涉及抗体制备技术领域。本发明通过使用植物蛋白酶对卵黄抗体IgY进行水解消化，产生完整的有抗原结合活性的Fab段和有可结晶活性的Fc段。经所述水解后，即可利用盐析和离子交换层析相结合的方法进行简便有效的分离，从而得到Fab和Fc。经实施例验证，该方法纯化的Fab和Fc组分具有高纯度，Fab和Fc两个片段的纯度分别为88.7％和90.1％，与其他方法相比，该方法简单易行，分离出的活性片段易于使用。

技术领域

本发明属于抗体制备技术领域，具体涉及一种从卵黄抗体IgY中分离Fab和Fc片段的方法。

背景技术

鸡卵黄抗体(IgY)是一种主要存在于鸡卵黄中重要的免疫球蛋白，其蛋白结构中有两个相同的Fab片段和一个Fc片段，IgY与哺乳动物IgG相比有很多优势，可以很容易地从鸡蛋中获得(100-150mgIgY/每个蛋黄)；针对哺乳动物抗原具有高亲和力；与哺乳动物IgG的交叉反应较小；不激活或识别哺乳动物补体；不与类风湿因子(RF)发生反应。最近的研究表明，完整的免疫球蛋白片段对免疫反应具有显著影响。

Fab片段由部分H链(VH+CH1)和整个Lchain(VL+CL1)组成，具有抗原结合位点。由于Fc片段(抗原部分)的裂解，Fab片段已发展成为比完整抗体性能更好的抗菌剂，并广泛用于诊断学和生物制药研究。此外，由于其亲和结合能力，Fab片段可用作纯化研究中的配体。可结晶片段(Fc)通过与特定Fc受体的相互作用对触发免疫防御至关重要，其包含整个重链的两个或三个结构域，CH2、CH3和CH4。

利用Fc的糖基化可以设计出具有高治疗功效和药代动力学的抗体。许多研究人员还使用Fc区域研究了IgY转运到蛋黄中的机制。Vermeer，Norde和Van表明稳定的Fab和Fc片段可以在完整的免疫球蛋白中充当独立的亚基，并建议可以使用分离的Fab和Fc片段独立研究Fab和Fc的功能。因此，分别收集Fab和Fc片段是有意义的。

基于目前先进的重组DNA技术，可以利用哺乳动物细胞或大肠杆菌细胞进行瞬时表达，以获得合适的Fab和Fc片段，但是该方法非常昂贵，且有时合成的Fc不起作用；另有研究表明，菠萝蛋白酶可将IgY消化出Fc片段和Fab片段，但其主要为Fc3-4(残基346-566)，其大小为53kDa，而Fab的值为44kDa；同样的，应用胃蛋白酶时长将Fc片段水解成碎片，因此缺乏简便的方法从IgY中分离出有活性且完整的Fab和Fc。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从卵黄抗体IgY中分离Fab和Fc片段的方法，可显著提高蛋白片段的完整度和纯度，方法简便并保持各片段活性。

本发明提供了一种从卵黄抗体IgY中分离Fab和Fc片段的方法，包括以下步骤：使用植物蛋白酶水解卵黄抗体IgY，利用45％饱和度的硫酸铵溶液处理酶解液，离心收集沉淀；

将所述沉淀溶解后加载到DEAE-Sepharose离子交换柱上，利用10mM Tris-HCl缓冲液洗脱Fab部分；再用含有0.21MNaCl的10mMTris-HCl缓冲液洗脱与DEAESepharose结合的Fc部分。

优选的，所述植物蛋白酶包括木瓜蛋白酶和/或菠萝蛋白酶。

优选的，所述水解的温度为37℃，时间为5h。

优选的，所述植物蛋白酶和卵黄抗体IgY的质量比为0.2:5。

优选的，所述水解时，将植物蛋白酶的溶液与卵黄抗体IgY的溶液混合；

其中植物蛋白酶的溶液的制备方法包括：将木瓜蛋白酶粉末溶解在含有20mM乙二胺四乙酸二钠盐的0.1M、pH7.0PBS中，并与终浓度为100mM的半胱氨酸混合，37℃孵育3小时，得植物蛋白酶的溶液；

所述卵黄抗体IgY的溶液以0.1M的PBS为溶剂。