[发明专利]一种多重荧光定量PCR检测试剂盒及应用

说明书

本发明涉及生物技术中的病毒检测技术领域，特别涉及一种多重荧光定量PCR检测试剂盒及应用。试剂盒中的反应液中含有一对通用引物和4条特异性TaqMan探针，并标记不同荧光基团，实现一个反应体系可同时鉴别PRRSV经典毒株、高致病性毒株、类NADC30毒株和NJ‑1106R疫苗毒株，具有特异性强、灵敏度高的特点。多重荧光PCR提高了检测效率，降低了检测成本，为同时鉴别诊断临床上的PRRSV毒株类型提供了技术支持。

技术领域

本发明涉及生物技术中的病毒检测技术领域，特别涉及一种多重荧光定量PCR检测试剂盒及应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)引起的猪的一种繁殖障碍和呼吸系统传染病，主要引起妊娠母猪流产、死胎和产木乃伊胎，仔猪表现为呼吸障碍。PRRS已成为全球养猪业中最严重的疾病之一，该病自1995年传入我国，2006年我国爆发高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HP-PRRS)，2013年出现的类NADC30毒株均给我国养猪业造成了严重的经济损失。

根据PRRSV基因组的序列差异度，将其分为以Lelystad virus(LV)为代表的欧洲基因型和以经典毒株VR-2332为代表的美洲基因型。两种毒株在形态和理化性状上相似，但在抗原性和细胞嗜性方面不同。欧洲型和美洲型毒株基因序列存在很大的差异，其中Nsp2基因差异较大，对应的氨基酸同源性仅有32％左右。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)与以往流行的PRRSV毒株有较大程度的变异，其中Nsp2基因缺失30个氨基酸(以经典毒株VR-2332为基准，482位和538–566位)常被作为该类变异毒株的标志。类NADC 30毒株特征性的在Nsp2区域缺失了131个氨基酸(以经典毒株VR-2332为基准，分别为323–433位置的111个氨基酸，482位置1个氨基酸和534–552位置的19个氨基酸，缺失模式为“111+1+19”)。

2011年，南京某规模化猪场仔猪表现出温和呼吸道问题，采集出现轻微高烧和咳嗽症状的仔猪的肺脏和淋巴结，分离到一株中等毒力的PRRSV NJ-1106株(GenBank登录号JX880029)，经反转录－聚合酶链式反应(RT-PCR)、间接免疫荧光实验(IFA)、全基因测序分析等方法鉴定，证实分离株为PRRSV。经连续传代至150代，获得人工致弱毒株NJ-1106R作为疫苗候选毒株，该毒株与经典PRRSV毒株(以VR-2332毒株为基准)相比在Nsp2基因上除了缺失常见的30个氨基酸(482位和538–566位)以外，在621–764位还缺失了144个氨基酸。

目前还没有一种同时针对PRRSV经典毒株、高致病性毒株、类NADC30毒株和NJ-1106R疫苗毒株的多重荧光定量PCR检测方法。

发明内容

本发明提供一种能够同时鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株、高致病性毒株、类NADC30毒株和NJ-1106R疫苗毒株的多重荧光定量PCR检测方法。

本发明是通过以下操作实现的：

一种多重荧光定量PCR检测试剂盒，所述多重荧光定量PCR检测试剂盒中的反应液中含有以下引物和探针：

PRRSV-F：5’-TTATTCTCCGGGTGATTGGG-3’，

PRRSV-R：5’-CTACACTCTGGCGAGTCAAACT-3’，

P1：JOE-TGCCTCTTTTTATGTTACAGTTACCCAGCCTTTG-BHQ1，

P2：FAM-TGCCTCTTTCTATGTTACAGTTACCCATTCTTCG-BHQ1，