[发明专利]一种同时检测CyHV-2和CyHV-3的双重TaqMan荧光定量PCR引物和探针组及应用

说明书

本发明公开了一种同时检测CyHV‑2和CyHV‑3的双重TaqMan荧光定量PCR引物和探针组及应用。所述引物和探针组为CyHV‑2‑F、CyHV‑2‑R、CyHV‑2‑P、CyHV‑3‑F、CyHV‑3‑R和CyHV‑3‑P，序列分别如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:6所示。采用本发明的引物和探针组可以同时检测CyHV‑2和CyHV‑3，建立的CyHV‑2和CyHV‑3双重Taqman qPCR检测方法具有特异性强、灵敏性高和重复性好的优点，可用于临床上CyHV‑2和CyHV‑3的快速定量检测和鉴别诊断。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同时检测CyHV-2和CyHV-3的双重TaqMan荧光定量PCR引物和探针组及应用。

背景技术

鲫鱼和鲤鱼是我国主要的淡水养殖鱼类，同时也是我国重要的经济鱼类，因其肉质细嫩，味道鲜美而深受消费者青睐，为人们提供了重要的蛋白质来源。金鱼和锦鲤历来都是重要的观赏鱼类，因其承载了人们的情感寄托，在市场均具有较高的个体经济价值。通过杂交选育技术，我们培育出了许多优质的杂交品种，如异育银鲫、湘云鲫等杂交鲫鱼以及丰鲤、荷元鲤等杂交鲤，极大地丰富了水产养殖品系。

鲤疱疹病毒是一种极易感染锦鲤、金鱼、鲫鱼、鲤鱼等鲤科鱼类及其杂交种的病毒，其病程发展迅速、传染性强、发病范围广，目前尚无有效的治疗方式，一旦爆发该疾病将会给水产养殖产业造成极大的经济损失。感染鲤科鱼类的疱疹病毒有鲤痘疮病毒(Cyprinid herpesvirus-1,CyHV-1)、鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)和鲤疱疹病毒3型(CyHV-3)三种类型，属于异疱疹病毒科鲤疱疹病毒属，其中以CyHV-2和CyHV-3具有高致死率而备受关注。该疾病可引起各生长阶段鲤科鱼类如鲤鱼和锦鲤肾脏红肿出血、烂鳃和呼吸困难从而导致死亡，严重危害鲤鱼和锦鲤的养殖。

目前已知的检测鲤疱疹病毒的方法包括临床诊断、透射电镜观察、酶联免疫、免疫荧光及PCR检测等。随着分子生物学技术的发展，qPCR因其快速、灵敏、准确等特点被广泛应用于病原检测。CyHV-2和CyHV-3可感染大部分的鲤科鱼类，致死率高但对不同鲤科鱼类致病力也不一样，其中CyHV-2主要危害鲫鱼、金鱼及其杂交种，可引起造血组织坏死从而导致死亡，鲤、锦鲤及其杂交种对鲤疱疹病毒3型更敏感。由于不同鲤疱疹病毒对不同品种鲤科鱼类产生的危害不同，开发一种可同时检测两种类型鲤疱疹病毒的方法显得非常重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种同时检测CyHV-2和CyHV-3的双重TaqMan荧光定量PCR引物和探针组及应用。

为了实现上述目的，本发明针对CyHV-2型与3型病毒的保守区多个基因序列设计了多对引物，筛选出2对特异性引物，通过优化反应条件，建立了检测鲤疱疹病毒2型和3型的双重TaqMan qPCR方法，该引物扩增CyHV-2型与3型特异性强、扩增效率较高，该检测方法基于对应病毒的保守区引物建立，可快速准确检测到病毒，为鲤疱疹病毒的诊断提供了重要的实验室手段。

本发明的一个方面，提供了一种用于同时检测鲤疱疹病毒2型和3型的双重TaqMan荧光定量PCR引物和探针组，其由CyHV-2的上游引物CyHV-2-F、下游引物CyHV-2-R和探针CyHV-2-P以及CyHV-3的上游引物CyHV-3-F、下游引物CyHV-3-R和探针CyHV-3-P组成，所述CyHV-2-F、CyHV-2-R、CyHV-2-P、CyHV-3-F、CyHV-3-R、CyHV-3-P的核苷酸序列及修饰依次如下所示：

CyHV-2-F：CACCACCATCACCACCTAGTA(SEQ ID NO:1)；

CyHV-2-R：TCATCATCATCATCATCGGACTCT(SEQ ID NO:2)；

CyHV-2-P：FAM-ACCTGTGGTAGCGCCAGACCT-BHQ1(SEQ ID NO:3)；