[发明专利]一种鉴定或辅助鉴定水牛角药材的引物对及DNA条形码、方法和应用

说明书

本发明公开了一种鉴定或辅助鉴定水牛角药材的引物对及DNA条形码、方法和应用，所述DNA条形码的核苷酸序列选自SEQ ID NO1 Bubalus Bubalis。本发明设计的3种牛角通用引物对可有效区分水牛角、牦牛角和黄牛角，为水牛角质量标准的完善提供依据，并且能够对水牛角、黄牛角、牦牛角药材进行鉴别。

技术领域

本发明涉及一种中药材鉴定的分子生物学方法，具体为一种鉴定或辅助鉴定水牛角药材的引物对及DNA条形码、方法和应用。

背景技术

水牛角为牛科动物水牛Bubalus bubalis Linnaeus的角，药用始载于《名医别录》，列为中品，日：“水牛角疗时气寒热头痛”。《本草纲目》载：“水牛色青苍，大腹锐头，其状类猪，角若担矛，卫护其犊，能与虎斗，亦有白色者”。从形态描述分析，古代本草所载药用水牛与今一致。现代研究表明，水牛角主要含有蛋白质类、肽类、氨基酸类、胆甾醇、胍基衍生物、微量元素等成分，具清热凉血，解毒，定惊之功效。中医临床常用水牛角及其方剂治疗热证，疗效确切。随着人们对水牛角及其配方中成药的认可，资源应用日趋广泛。水牛角主产于广西、云南、贵州、湖北、四川、湖南、江西、安徽等长江以南地区。经调研，市售水牛角的商品以水牛角丝、水牛角尖、水牛角浓缩粉等为主，缺乏完整性状鉴定特征，难以准确鉴定到物种。据统计，市售水牛角中正品仅占50％左右，其余均以牦牛角和黄牛角冒充水牛角销售，严重影响中药质量和市场秩序，因此，急需建立一种能够准确鉴定水牛角基原的方法。

关于水牛角及其近似品的鉴别研究，画红顺比较羚羊角和水牛角薄层色谱图，结果表明，羚羊角和水牛角所显示的斑点颜色和位置均相同，无明显区别。李晓蒙等采用HPLC法鉴别水牛角与羚羊角，结果表明，水牛角和羚羊角的氨基酸种类与水牛角的氨基酸种类基本一致，但氨基酸含量有较大的差异。唐慧英等采用傅里叶变换红外光谱法(FTIR)并结合二阶导数谱分析鉴别鹿茸、鹿角、羚羊角、水牛角4种角类动物药，结果表明，水牛角和羚羊角在红外原始谱图和导数光谱相似性都很大，从峰强度看，羚羊角集中成分的含量高于水牛角。刘旭朝以COI序列为DNA条形码，取水牛角及其易混品样品，建立基于DNA条形码技术的水牛角及其易混伪品鉴定方法。

《中国药典》2020年版水牛角项下仅有性状与粉末显微鉴别项，水牛角浓缩粉项下有性状、检查、浸出物、含量指标，动物药材大多外形已破坏、显微特征不明显、化学成分特异性不强，上述方法与指标无法全面评价水牛角药材，不能对水牛角及其近缘种进行区分。上述文献对水牛角正伪品鉴别的方法主要存在以下缺陷：

1、薄层色谱法、红外法、高效液相法等已应用于水牛角的鉴别及区分其他角类，但是由于专属性不强，或检测灵敏度不高，不能行之有效地用于水牛角鉴别，尤其是近缘物种的鉴别。

2、以上用于扩增COI的通用引物对，通用性较强，特异性则相对较差，容易受到外源DNA污染，动物药材因含有大量的营养成分，在加工、存储、运输过程中易滋生细菌、真菌、寄生虫和仓储害虫，在使用通用引物鉴定时，则容易受到外源DNA污染，无法进行鉴定。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一种用于水牛角药材鉴定的引物、DNA条形码序列及鉴别方法，该方法专属性强，操作简单，灵敏度高，可有效区分水牛角及其近缘种黄牛角和牦牛角。

技术方案：本发明所述的水牛角的DNA条形码，所述DNA条形码的核苷酸序列选自SEQ ID NO1 Bubalus Bubalis。

牛角的DNA条形码组合，所述DNA条形码组合的核苷酸序列包括用于检测水牛角的SEQ ID NO1 Bubalus Bubalis、用于检测牦牛角的SEQ ID NO2 Bos grunniens和用于检测黄牛角的SEQ ID NO3 Bos taurus。

所述的DNA条形码或所述的DNA条形码组合的引物对，所述引物对序列：

正向引物NJ324-F：5’-GGAGAAGCCCCGGCAGAATT-3’