[发明专利]一种长寿酶的生物制备方法

权利要求书

1.一种长寿酶的生物制备方法，其特征在于，包括：将诱导关键酶编码基因--烟酰胺酶基因PNC1和烟酰胺磷酸核糖转移酶基因NPT1过表达的酿酒酵母工程菌NM01经活化后接种到发酵培养基进行摇瓶发酵培养，外源添加底物烟酰胺，酿酒酵母工程菌NM01经发酵实现长寿酶的生产。

2.如权利要求1所述的长寿酶的生物制备方法，其特征在于，菌株NM01以酿酒酵母BY4741为出发菌株，过表达基因PNC1和NPT1；

其中，将基因PNC1和NPT1构建为融合蛋白；将PNC1和NPT1的融合蛋白基因构建到酵母表达载体pESC-URA的第一个多克隆位点；

基因PNC1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，基因NPT1的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；酵母表达载体pESC-URA的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

3.如权利要求1所述的长寿酶的生物制备方法，其特征在于，摇瓶发酵培养包括：将生产NMN的酿酒酵母工程菌NM01接种到SD+URA固体培养基上，置于30℃恒温培养箱中培养48h；挑取单克隆接种至含有5mLSD+URA液体培养基的试管中，于30℃220rpm条件下震荡培养至OD值2～3；取1mL菌液接种到含50mLSD+URA液体培养基的250mL三角瓶中，在30℃条件下220rpm震荡发酵24h；外源添加烟酰胺溶液，继续发酵24h，得到长寿酶NMN。

4.如权利要求1所述的长寿酶的生物制备方法，其特征在于，长寿酶的生物制备方法包括以下步骤：

步骤一，进行PNC1和NPT1基因融合蛋白表达载体的构建；

步骤二，通过菌株的转化筛选培养，构建菌株NM01；

步骤三，利用菌株NM01制备长寿酶NMN。

5.如权利要求4所述的长寿酶的生物制备方法，其特征在于，步骤一中的PNC1和NPT1基因融合蛋白表达载体的构建包括：

(1)利用GSGlinker将PNC1和NPT1基因连接，构建融合基因PNC1-NPT1；

(2)利用限制性内切酶SacI和NotI酶切酵母表达载体pESC-URA，将PNC1和NPT1的融合蛋白基因PNC1-NPT1与线性化载体连接；

(3)将与线性化载体连接的融合蛋白基因PNC1-NPT1构建到pESC-URA的第一个多克隆位点，获得载体pESC-URA-PNC1-NPT1。

6.如权利要求5所述的长寿酶的生物制备方法，其特征在于，PNC1和NPT1基因从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到。

7.如权利要求4所述的长寿酶的生物制备方法，其特征在于，步骤二中的菌株NM01的构建包括：

将载体pESC-URA-PNC1-NPT1转化酿酒酵母菌株BY4741，利用酵母缺陷型培养基SD-URA筛选培养，得到酿酒酵母工程菌菌株NM01。

8.如权利要求7所述的长寿酶的生物制备方法，其特征在于，酵母转化为利用酵母转化试剂盒进行转化；优选为利用ZymoResearchFrozen-EZYeast TransformationIIKitTM酵母转化试剂盒进行转化。

9.如权利要求4所述的长寿酶的生物制备方法，其特征在于，步骤三中的长寿酶NMN的制备包括：将酿酒酵母工程菌菌株NM01进行发酵，并外源添加烟酰胺，继续发酵得到长寿酶NMN。

10.如权利要求9所述的长寿酶的生物制备方法，其特征在于，发酵的碳源为葡萄糖和半乳糖。