[发明专利]一种长寿酶的生物制备方法

说明书

本发明属于微生物制备技术领域，公开了一种长寿酶的生物制备方法，利用GSGlinker将PNC1和NPT1基因连接，构建融合基因PNC1‑NPT1；将融合蛋白基因PNC1‑NPT1与线性化载体连接后构建到pESC‑URA的第一个多克隆位点，获得载体pESC‑URA‑PNC1‑NPT1；将载体pESC‑URA‑PNC1‑NPT1转化酿酒酵母菌株BY4741，利用酵母缺陷型培养基SD‑URA筛选培养，得到酿酒酵母工程菌菌株NM01；将酿酒酵母工程菌菌株NM01进行发酵，并外源添加烟酰胺，继续发酵得到长寿酶NMN。本发明基于过表达PNC1和NPT1融合基因催化酵母长寿酶生物合成的新方法效果显著。

技术领域

本发明属于微生物制备技术领域，尤其涉及一种长寿酶的生物制备方法。

背景技术

长寿酶(Nicotinamide Mononucleotide，NMN)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+的直接前体，能够逆转线粒体功能异常，降低活性氧的产生，并减缓NAD+不足引起的DNA修复缺陷，在抗衰老方面表现出惊人的潜力，可有效延长生命体寿命。近年来，NMN在一些老年疾病，如脑出血、阿尔茨海默氏病、帕金森病、II型糖尿病等的治疗过程中表现出良好的效果。目前NMN的获取方式主要有两种，化学合成和酶法合成。化学合成法对于NMN在食品保健品中的应用具有局限性，并且化学合成法使用大量的有机溶剂，反应条件苛刻，对环境生态不友好；酶法合成可以实现NMN的一步合成，但生产成本很高。因此，绿色低成本的制备方法，成为NMN生产的有效途径。

生物转化法是利用微生物在代谢过程中产生的一类或一系列酶对底物的催化或修饰反应，达到生产目标产物的方法，该方法可选择的微生物种类多、酶系丰富，具有特异性强、反应条件温和、转化率高、污染小、分离提纯方便等优点。以往有报道利用大肠杆菌作为生物转化的宿主，通过将烟酰胺磷酸核糖转移酶和5’-磷酸核糖焦磷酸合成酶在大肠杆菌中重组表达，并以烟酰胺和乳糖为底物进行发酵获取NMN，但最终NMN的产量很低，仅为15.4mg/L。该体系NMN产量低下的原因在于大肠杆菌中没有生成NMN的酶，外源引入的烟酰胺磷酸核糖转移酶在细胞中的蛋白可溶性差，催化活性严重丧失。

因此，寻找一种具有内源性催化NMN合成途径的生物转化体系，成为突破NMN产量低下这一瓶颈的关键。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)化学合成法对NMN在食品保健品中的应用具有局限性，且使用大量有机溶剂，反应条件苛刻，对环境生态不友好；酶法合成法的生产成本高。

(2)由于大肠杆菌中没有生成NMN的酶，外源引入的烟酰胺磷酸核糖转移酶在细胞中的蛋白可溶性差，催化活性丧失严重，导致NMN的产量较低。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种长寿酶的生物制备方法，尤其涉及一种具有内源性催化长寿酶合成途径的生物转化体系及其在利用提供的生物转化体系构建生产长寿酶的酿酒酵母工程菌中的应用。

本发明是这样实现的，一种长寿酶的生物制备方法，长寿酶的生物制备方法包括：将诱导关键酶编码基因--烟酰胺酶基因PNC1和烟酰胺磷酸核糖转移酶基因NPT1过表达的酿酒酵母工程菌NM01经活化后接种到发酵培养基进行摇瓶发酵培养，外源添加烟酰胺，酿酒酵母工程菌NM01经发酵生产长寿酶。

进一步，菌株NM01以酿酒酵母BY4741为出发菌株，过表达PNC1和NPT1；

其中，将PNC1和NPT1构建为融合蛋白；将PNC1和NPT1的融合蛋白基因构建到酵母表达载体pESC-URA的第一个多克隆位点；

基因PNC1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，基因NPT1的核苷酸序列为SEQID NO.2；酵母表达载体pESC-URA的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。