[发明专利]一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶及构建方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶及构建方法。所述一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶包括由TdT经切割得到的两个TdT蛋白结构域，所述两个TdT蛋白结构域分别记为TdT‑D1和TdT‑D2，当所述TdT‑D1和TdT‑D2分别单独存在时不独立表现出TdT催化活性；当所述TdT‑D1和TdT‑D2同时存在且靠近时，TdT‑D1和TdT‑D2会发生重组并表现出TdT催化活性。本发明设计可分裂重组的TdT，通过调控TdT‑D1和TdT‑D2的相对距离，实现TdT酶活性的灵活调控。基于TdT‑D1和TdT‑D2的酶法DNA合成不再需要依赖保护剂和去保护剂即可实现DNA合成酶活性的调控，从而明显简化了DNA人工合成的循环步骤。本发明为灵活、简便地调控TdT酶活性提供了新模式。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶及构建方法与应用。

背景技术

DNA人工合成技术是现代基因技术的重要基础。DNA人工合成的关键方法包括：柱式化学寡核苷酸合成、芯片化学寡核苷酸合成、寡核苷酸纯化、寡核苷酸拼装、基因合成纠错与克隆筛选、大片段基因合成组装，以及DNA的新一代酶法合成。DNA人工合成的传统方法大多依赖亚磷酰胺化学完成反应。近年来以酶促合成为原理的第三代DNA人工合成逐渐崛起，成为前景广阔的DNA人工合成方法。其中以末端脱氧核糖核苷转移酶(TdT)为核心的酶促合成技术是极具前景的DNA合成策略。

新型核苷酸酶促合成法是利用非模版依赖性的DNA末端核酸转移酶(TdT)进行体外的寡核苷酸片段合成。TdT由Bollum首先发现并提出该酶可用于单链寡核苷酸的合成。随后Schott和Schrade研究发现，TdT对四种核苷酸的偏好性差异小、偶联效率高，持续合成和延伸单链DNA可产生长达8000nt的均聚物。为了实现TdT催化的可控DNA合成，DNA合成酶的活性需要被可逆控制。Keasling团队在2018年构建的TdT催化活性控制机制利用了TdT与单个核苷酸的可逆共价键链接，用于阻止TdT催化合成的DNA链的进一步延伸。当该可逆共价键链接断裂后，DNA链便可进入新的核苷酸添加循环。该方法平均偶联效率可达97.7％，单个循环需2～3min。基于创新TdT的DNA合成得到了学术界和工业界的普遍关注。

由于TdT越发显著的DNA合成应用，针对TdT开展酶工程设计以实现TdT酶活性的灵活调控意义逐渐凸显。现有实现TdT酶活性调节的方法选择有限，主要依赖人工修饰的特异性脱氧核糖核苷酸作为TdT底物，并在底物分子3’-OH上添加保护基团。该保护基团形成的空间位阻有效阻挡了下一个底物单体的连接过程。但在添加下一个碱基时，需要对3'末端的保护基团进行脱保护处理，然后才能进行下一步循环反应。因此，现有基于TdT的DNA合成仍需要多步反应才能实现，限制了酶法DNA合成的自动化程度。

针对该问题，本发明设计了可分裂重组的TdT结构域，进而通过控制TdT蛋白结构域(TdT-D1，TdT-D2)的相互作用显著调控TdT酶催化活性，不再需要依赖保护剂和去保护剂。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶及构建方法与应用，旨在解决现有调节TdT酶活性的方法需要依赖保护剂和去保护剂，导致基于TdT的DNA合成仍需要多步反应才能实现的问题。

本发明的技术方案如下：

一对可分裂重组的末端脱氧核苷酸核酸转移酶，其中，包括由TdT经切割得到的两个TdT蛋白结构域，所述两个TdT蛋白结构域分别记为TdT-D1和TdT-D2，当所述TdT-D1和TdT-D2分别单独存在时不独立表现出TdT催化活性；当所述TdT-D1和TdT-D2同时存在且靠近时，TdT-D1和TdT-D2会发生重组并表现出TdT催化活性。