[发明专利]西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系的荧光定量内参基因及其引物

说明书

本发明公开了西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系的荧光定量内参基因及其引物。本发明从多个候选内参基因中筛选出DnaJ基因，在ECM真菌定殖不同时期根系(采用无菌互作体系接种彩色豆马勃0、1、2、7d时的西南桦组培苗根尖)和西南桦不同组织(组培苗根、组培苗茎、组培苗叶、嫁接苗茎尖、嫁接苗幼茎、嫁接苗雄花序)中的表达稳定性强。即DnaJ基因在西南桦ECM真菌定殖不同时期根系以及不同组织中表达稳定，能够作为西南桦外生菌根形成过程及不同组织荧光定量PCR的内参基因。本发明还提供了DnaJ基因的qRT‑PCR引物，为西南桦外生菌根形成过程及不同组织基因表达的精确定量分析奠定了基础。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系的荧光定量内参基因及其引物。

背景技术

西南桦(Betula alnoides Buch.-Ham.ex D.Don)是我国热带、南亚热带地区的速生乡土珍贵树种。其木材材质优良、用途广泛，尤其是西南桦家具、木地板等深受市场青睐；树皮可入药，用于治疗眼疾、感冒、风湿和消化道疾病等。近20年来，西南桦人工林发展迅速，已成为该地区造林面积最大的乡土阔叶树种之一。由于其重要的经济价值和研究价值，西南桦的分子生物学研究逐渐受到重视。

利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析基因表达水平是现代分子生物学研究中的重要手段，因其定量准确、特异性强、灵敏度高及高通量的优点被广泛应用于基因表达分析。在qRT-PCR中，对目标基因相对表达量的分析主要通过内参基因的均一化来确定，因此，选择合适的内参基因非常关键。理想的内参基因应该在各种环境条件下、在不同的组织和细胞中都能恒定或相对稳定地表达。常用的内参基因有肌动蛋白家族(ACTIN)、核糖体蛋白基因(Ribosomal protein L,RPL)、转录延伸因子基因(Elongation factors 1alpha,EF-1α)、多聚泛素酶基因(ubiquitin,UBQ)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、β微管蛋白基因(tubulin,TUB)等。但这些广泛应用的内参基因在不同植物品种及不同实验条件下表达的稳定性差异很大，甚至可能截然相反，盲目地使用一种内参基因会影响试验结果的准确性。因此，选择何种内参基因对于定量PCR结果是否准确显得尤为重要。迄今为止，关于西南桦内参基因特别是在外生菌根(ECM)形成过程中内参基因的筛选几乎没有报道。因此，筛选出稳定的内参基因对西南桦基因表达分析乃至西南桦分子生物学研究至关重要。

发明内容

本发明之目的在于，提供西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系的荧光定量内参基因及其引物。

本发明根据前期的转录组测序数据，应用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和Delta CT四个分析软件对包括泛素接合酶基因(UBC1和UBC2)、转录延伸因子基因(EF-1α)、DEAD-box RNA解旋酶基因(DDX)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)、分子伴侣蛋白基因(DnaJ)、40S核糖体蛋白基因(40S RP)、肌动蛋白基因(ACT)和亲环蛋白基因(CYP)在内的九个候选内参基因在西南桦不同组织(组培苗根、组培苗茎、组培苗叶、嫁接苗茎尖、嫁接苗幼茎、嫁接苗雄花序)和ECM真菌定殖不同时期西南桦根系(采用无菌互作体系接种彩色豆马勃0、1、2、7d时的西南桦组培苗根尖)中的表达稳定性进行了分析。结果表明DnaJ基因在西南桦不同组织及ECM真菌定殖不同时期根系中稳定表达，即DnaJ基因能够作为qRT-PCR的内参基因对目标基因的表达水平进行归一化，解决了西南桦不同组织基因及参与ECM共生体形成基因的表达分析方面缺乏合适内参基因的问题。

本发明的第一个目的是提供DnaJ基因作为西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系的荧光定量内参基因的应用，所述的DnaJ基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

DnaJ基因在西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系中具有良好的稳定性，为准确定量分析西南桦功能基因转录表达水平奠定基础。