[发明专利]耐中性环境的海因酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种海因酶突变体SEQ ID NO:3，其在pH6.5‑7.5中性反应体系中高效催化D‑对羟基苯海因水解为N‑氨甲酰‑D‑对羟基苯甘氨酸，并且可与氨甲酰水解酶组合催化D,L‑对羟基苯海因合成D‑对羟基苯甘氨酸，具有较好的工业应用前景。

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体地说，涉及一种海因酶突变体及其在制备N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸和D-对羟基苯甘氨酸中的应用。

背景技术

D-对羟基苯甘氨酸(D-p-hydroxyphenylglycine，简写D-HPG)又称左旋对羟基苯甘氨酸，分子式为C₈H₉NO₃，结构式如下：

D-HPG是合成β-内酰胺类半合成广谱抗生素，如阿莫西林、头孢羟氨苄、羟氨苄唑头孢的重要中间体。这类抗生素具有优异的生理功能，诸如抗菌谱广泛，不良作用低，过敏性低，口服效果好，作用时间长等优点。此外，D-HPG也是一些抗菌和抗病毒药物、人工甜味剂的中间体。

D-HPG的合成方法包括化学合成法和生物酶法。化学法可分为苯甲醛法、β-环糊精法、对羟基苯海因法、活泼酰胺基化合物反应法与乙醛酸法等(D,L-对羟基苯甘氨酸的合成研究.应用化工,2003,32(05):46-49)。但是化学合成法具有反应收率低、能耗高、消旋体手性拆分剂价格高等缺点，不符合当下绿色制造的理念。生物酶法是以D,L-对羟基苯海因为原料，D-海因酶和氨甲酰水解酶发挥拆分和水解的催化作用生成D-HPG，具有反应步骤少、催化效率高和环境友好等优点，近年来备受关注(Production of D-p-Hydroxyphenylglycine by N-Carbamoyl-D-aminoAcid Amidohydrolase-OverproducingEscherichia coli Strains.Biotechnol Prog,1999,15(4):603-607.王亚盟,班睿,刘露,申雨.异源D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达重组枯草芽孢杆菌的构建.微生物学报,2017,57(1):54-65.)。

D-海因酶能选择性地将D-对羟基苯海因水解为N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸(NC-D-HPG)，残留的L-对羟基苯海因在中性或碱性条件下会迅速自发地消旋为D,L-对羟基苯海因，NC-D-HPG在氨甲酰水解酶的作用下生成D-HPG。

生物酶法可分为双菌/双酶法和一菌双酶法，在专利文献CN103993010A、CN110396484A、CN110699396A、CN111621452A、CN112080532A中都有报道。对羟基苯海因在碱性条件下不稳定，会发生自发消旋，因此在酶反应时需要通氮气隔离空气(双酶法合成D-对羟基苯甘氨酸.中国药科大学学报,2001,32(2):155-158)。并且氨甲酰水解酶(DCase)在中性条件下活力高，但在碱性条件下氨甲酰水解酶受到副产物NH4⁺的抑制导致活性降低(Biotechnol Prog,1999,15(4):603-607)。而海因酶(DHase)在较高pH值(pH值8～9)的稳定性较好，但是在pH值低于8.0时酶失活较快。这两种酶对于不同酸碱度的适应性相互矛盾，为了从原料对羟基苯海因出发制备D-对羟基苯甘氨酸，提高底物的酶转化效率，CN112080532A提供了一种级联酶反应，以D,L-对羟基苯海因为底物，首先加入海因酶，在无氧环境中于pH为9.5～11反应得到中间反应液；将中间反应液进行超滤除杂，然后将N-氨甲酰水解酶加入超滤透过液中，在无氧环境中于pH为7.0～8.5反应至结束，得到D-对羟基苯甘氨酸。该级联反应的缺点也很明显，首先每步反应后都需要进行繁琐的后处理，二是两种酶的酶活力和投料量需要进行实验匹配，必然导致成本上升。综合来看，采用两种酶共表达的一菌双酶法是更理想的选择。

发明内容