[发明专利]一种β-葡萄糖苷酶、表达载体、宿主细胞和应用

说明书

本发明属于分子生物学领域，涉及酶法提取，特别是指一种β‑葡萄糖苷酶、表达载体、宿主细胞和应用。本发明从奶牛粪便宏基因组文库中克隆到了一个β‑葡萄糖苷酶基因，将该β‑葡萄糖苷酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，该菌株异源表达制备的β‑葡萄糖苷酶在适宜条件下不仅能高效转化淫羊藿苷为宝藿苷I，还可高效转化黄芩苷为黄芩素。转化淫羊藿苷为宝藿苷I的转化率最高可达100%，转化黄芩苷为黄芩素的转化率最高可达98%，证明了本申请的β‑葡萄糖苷酶cdw11实现了同时高效率制备宝藿苷I和黄芩素的目的。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及酶法提取，特别是指一种β-葡萄糖苷酶、表达载体、宿主细胞和应用。

背景技术

β⁃葡萄糖苷酶（β⁃glucosidase，EC 3.2.1.21），又称β-D-葡萄糖糖苷水解酶，是一类纤维素酶，能够从含糖化合物中催化水解末端的非还原性β⁃D⁃糖苷键，释放出β-D-葡萄糖及相应的单糖、寡糖或复合糖。β-葡萄糖苷酶根据氨基酸和结构相似性分属于GH1、GH2、GH3、GH5、GH9、GH30和GH116家族，被广泛用于食品、药品、酿酒等行业。β-葡糖苷酶还可以催化合成烷基糖苷，烷基糖苷可用作治疗剂、诊断工具、益生菌的生长促进剂和表面活性剂等。酶法反应条件温和、产物纯、易分离等优点而逐渐被人们选择。因此β-葡糖苷酶在合成糖苷及天然产物的改造中都发挥着极其重要的作用。

淫羊藿的主要活性成分为总黄酮（Total flavons of Epimedium，TFE），是在C-8位有异戊烯基的黄酮苷类，如多糖苷类化合物朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C；低糖苷类化合物淫羊藿苷、宝藿苷I以及苷元淫羊藿素。其中淫羊藿苷和朝藿定C具有天然丰度。淫羊藿苷（Icariin，ICA）是淫羊藿中含量最高的黄酮类成分，是其生物活性指标，具有多种药理作用，但口服利用率较低。淫羊霍次苷II(icariside II, ICS-II )又名宝藿苷I，结构式：，是淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C等多种淫羊藿黄酮化合物的主要代谢产物，同时也是吸收入血的主要成分之一。代谢和药代动力学研究表明，淫羊藿苷在体内被肠道菌群代谢，并以宝藿苷I的形式被吸收。ICA II还具有抗炎、抗骨质疏松、和抗癌活性，并且研究表明它通常比ICA更有效。同时淫羊藿苷与宝藿苷I两者之间仅相差一个葡萄糖，通过有效的手段选择性的切除淫羊藿苷上的葡萄糖残基，将获得低含量高附加值的产物宝藿苷I。生物酶法因其选择性强、副产物少、转化率高以及反应条件温和等优点逐渐被应用于天然产物的改性增效。张振海等发表的β-葡萄糖苷酶酶解淫羊霍苷制备宝藿苷I的工艺研究中，公开了利用β-葡萄糖酶酶解淫羊藿制备宝藿苷I的方案；而不同生物中克隆的β-葡萄糖苷酶酶的功能不同。

黄芩的主要有效成分为黄酮类化合物，以黄芩苷、黄芩素为主，具有抗炎、抗菌、抗病毒、保护神经、止血安胎等功效。黄芩苷口服不易被吸收，需要经过人体肠道菌群将其转化为黄芩素后才可被人体吸收利用。黄芩中黄芩素的含量很低，但黄芩苷含量可达7%～19%。如果能将黄芩苷C7位羟基上的葡萄糖醛酸脱除，转化为利于人体吸收的黄芩素，其结构式为：，这将极大的提高黄芩的利用价值。然而由于黄芩苷与淫羊藿苷的结构不同，性质差异大，常规的化学方法并不能同时获得黄芩素和宝藿苷I，且现有的生物酶法也不能实现同时获得这两种有效成分。为了利用同时获得这两种药物中的有效成分，本课题组进行了以下研究。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出一种β-葡萄糖苷酶、表达载体、宿主细胞和应用，提供了一种可同时将淫羊藿苷转化为宝藿苷I、黄芩苷转化为黄芩素得方案。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种β-葡萄糖苷酶，其对对硝基苯酚的比活力为854 U/mg。

其基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

一种重组载体，含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

一种宿主细胞，含有上述的β-葡萄糖苷酶；或者含上述的重组载体。