[发明专利]COL-12过表达线虫模型及其在药物筛选中的应用

权利要求书

1.一种COL-12过表达线虫模型建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)同源修复模板质粒的构建：Destination质粒和Entry质粒进行目的序列片段的交换重组，孵育，转化入大肠杆菌，涂布于培养基；

(2)显微注射和基因编辑：所述基因编辑为基于同源重组修复和crispr/cas9系统原理的基因编辑；向线虫中显微注射质粒，所述质粒包括质粒pSX493、质粒pSX2796、质粒pSX375、质粒pSX424和质粒pSX379；

(3)荧光筛选单拷贝转基因线虫：在注射成功的线虫培养板表面滴加潮霉素B，培养；挑选出注射成功的线虫，子代全部呈现旋转表型或是成年期皮肤表达绿色荧光时，取子代线虫裂解得基因组，进行PCR反应；挑选纯合单拷贝转基因线虫进行热激处理。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中Entry质粒携带Pcol-19-COL-12::GFP表达序列；Destination质粒携带线虫一号染色体ttTi4348位点模板。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中Entry质粒和Destination质粒的质量比为(0.04-1):1。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中线虫是L4幼虫期雌雄同体线虫。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中总质粒浓度区间为100-200ng/μL，质粒pSX493不超过50ng/μL，质粒pSX2796浓度不小于50ng/μL，质粒pSX375不超过2.5ng/μL，质粒pSX379不超过10ng/μL，质粒pSX424不超过5ng/μL。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中潮霉素B的浓度为5-20mg/mL。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中潮霉素B的浓度为10mg/mL。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中PCR反应的引物对为Zju137和Zju138；

所述Zju137的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述Zju138的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的热激处理的温度为32℃，处理的时间为3-5h。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法在药物筛选中的应用。