[发明专利]COL-12过表达线虫模型及其在药物筛选中的应用

说明书

本发明属于药物筛选与评价方法领域，涉及医药技术领域，具体涉及一种COL‑12过表达线虫模型及其在药物筛选中的应用。所述COL‑12过表达线虫模型的建立，包括以下步骤：(1)同源修复模板质粒的构建；(2)显微注射和基因编辑；(3)荧光筛选单拷贝转基因线虫。本发明的COL‑12过表达线虫模型可反应胶原蛋白的分泌，用于研究胶原分泌和组装。本发明的COL‑12过表达线虫模型清晰明确地标记了L4时期或成年线虫皮肤COL‑12在线虫角质外壳的定位，所有同期线虫的表达强度基本一致，可用于定量分析实验。该转基因纯合体线虫能够稳定传代，该转基因对线虫的发育无明显影响，便于进行其他遗传杂交和基因组实验。

技术领域

本发明属于药物筛选与评价方法领域，涉及医药技术领域，具体涉及一种COL-12过表达线虫模型及其在药物筛选中的应用。

背景技术

线虫以其体型小(新孵化幼虫体长0.25mm，成年线虫体长约1mm)、后代数量大(一条未同雄性杂交的雌雄同体约产后代300条)、生命周期短(从孵化到性成熟并开始产卵于25℃仅需三日)、通体透明、基因组遗传学背景了解程度清晰(全基因组已测序完成，雌雄同体自交繁衍便于获得并保留纯合型转基因或基因突变)、易于进行基因编辑操作(显微注射和RNA干扰操作简便)和养护花费小等许多优点，成为了经典的实验模式生物。高通量药物筛选技术具有样品需求量小、检测快速灵敏以及高度自动化等优点，被广泛的应用于大量样品的检测，达到低消耗高产出的实验结果，为药物发现提供新思路，而高内涵药物筛选技术在线虫模型上的应用较少。

COL-12是角质层的结构成分，是胶原蛋白三聚体的一部分。胶原蛋白是一类蛋白质家族，是生物高分子，胶原蛋白种类较多，常见类型为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型。根据其结构，可以分为纤维胶原、基膜胶原、微纤维胶原、锚定胶原、六边网状胶原、非纤维胶原、跨膜胶原等。目前，一般认为，胶原蛋白具备以下三个特点：1)至少具有一个三螺旋结构域；2)能够形成超分子聚集体；3)能够存在于细胞外基质中。同时，胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性、生物活性以及修复和更新肌肤的作用，而被应用于食品、医药、组织工程、化妆品等领域。

中国专利CN114058672A公开了一种高通量快速检测沙门氏菌毒力的秀丽隐杆线虫感染模型及制备方法与应用，所述的模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)沙门氏菌的培养及菌液的制备；(2)秀丽隐杆线虫的同期化培养，得到L4期线虫；(3)将步骤(2)得到的L4期线虫在含有步骤(1)得到的沙门氏菌菌液中共同培养2-4天即可。该发明通过建立沙门氏菌感染秀丽隐杆线虫模型，可以实现快速、简便、高效检测沙门氏菌毒力，为沙门氏菌的致病机理研究以及相关药物开发提供理论基础。

陈丽红等在文献利用秀丽隐杆线虫构建抗菌物质体内筛选模型中，利用秀丽隐杆线虫为模式生物，建立抗菌物质活体筛选模型，以铜绿假单孢菌感染线虫后，加入不同剂量已知抗生素治疗，观察线虫存活情况及体内细菌数量的变化，结果表明，线虫感染程度可量化操作，最佳操作参数为：铜绿假单孢菌培养时间10-12h，菌液浓度A600值1.0-1.2，线虫感染时间15h，抗生素的使用能够显著提高感染线虫存活状况，线虫存活率和药物剂量之间具有稳定的线性关系。但在现有技术中均未公开COL-12过表达线虫模型，Pcol-19-COL-12::GFP单拷贝转基因线虫模型的建立是全新的线虫模型，该模型可以反映胶原蛋白的分泌，可用于研究胶原分泌和组装等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种COL-12过表达线虫模型及其在药物筛选中的应用。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种COL-12过表达线虫模型建立的方法，包括以下步骤：

(1)同源修复模板质粒的构建：Destination质粒和Entry质粒进行目的序列片段的交换重组，孵育，转化入大肠杆菌，涂布于培养基；