[发明专利]一种扩繁莱氏绿僵菌Mr006的方法及其应用

说明书

本发明涉及微生物培养领域，确切地说是涉及一种莱氏绿僵菌的扩繁产孢方法及其应用。本发明通过将莱氏绿僵菌Mr006喷施在用亚致死剂量氯虫苯甲酰胺酰胺（0.008ug/g）处理过的斜纹夜蛾2龄期活幼虫上引发感染，将感染莱氏绿僵菌Mr006孢子斜纹夜蛾2龄期幼虫集中至无菌盒中，置于温度为（27±1）℃、相对湿度（70±5）%、光周期14L:10D的人工气候箱，以人工饲料继续饲养至死亡或化蛹。观察虫体侵染情况，待第1次完全产孢后收集孢子，僵虫保湿后，继续扩繁培养再重复收取2次孢子，获得了最大产孢量。本发明通过利用斜纹夜蛾虫体作为莱氏绿僵菌扩繁培养基，达到了缩短产孢时间，提高孢子产量及孢子含量，更新生产工艺，扩展废料用途，降低生产成本的目的。

技术领域

本发明涉及微生物培养领域，确切地说是涉及一种莱氏绿僵菌的扩繁产孢方法及其应用。

背景技术

现阶段，害虫对作物的危害是造成农业减产的重大因素之一。化学农药的长期大量使用在杀灭害虫的同时也带来了农产品药残超标，害虫抗性水平逐年上升，污染环境等一系列的副作用。鉴于此，生物防治被人们日益重视，利用昆虫病原微生物防治害虫是害虫生物防治的重要手段之一。与其他杀虫微生物相比，杀虫真菌具有易流行，对环境友好，不易产生抗药性等优点，在害虫的生物防治中占有重要地位。

莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)是一种在我国分布广泛的昆虫病原真菌，在自然界常常引发高强度的昆虫流行病，可侵染多种鳞翅目害虫，尤其对草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾等夜蛾科害虫的侵染力极高，具有较高的开发利用价值。然而，大部分真菌的研究工作都需要对真菌进行室内人工培养，且不同真菌对培养基的养分组成要求差异较大。菌株扩繁是影响应用前景的重要因素。目前莱氏绿僵菌发酵多采用廉价的麦麸、玉米粉、大米粉等农副产品为营养物质，以获得最大孢子产量，但产孢量仍有限。实验室中培养莱氏绿僵菌最常用的萨斯麦芽糖-酵母培养基和马铃薯培养基，但存在产孢率低、孢子萌发率低、产孢周期长和成本高、菌株退化较快等问题。

发明内容

本发明莱氏绿僵菌Mr006由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所生物防治团队从太和玉米种植区调查发现田间感染虫生真菌的草地贪夜蛾僵虫中分离鉴定获得。该莱氏绿僵菌Mr006已经公开在CN202210572361.8中，2022年5月9日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.40171。为了更好地开展对莱氏绿僵菌的相关研究，本发明对莱氏绿僵菌Mr006进行了进一步深入的研究，得出了扩繁莱氏绿僵菌Mr006的方法。

本发明通过选择草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、玉米螟、棉铃虫、二化螟等试虫作为培养基质，用亚致死剂量氯虫苯甲酰胺酰胺处理2龄期活虫，分析对莱氏绿僵菌Mr006产孢时间、产孢量、孢子含量的影响，最终分析得到了高效的莱氏绿僵菌Mr006孢子扩繁方法及其培养基。

本发明的一个方面，本发明提供了一种莱氏绿僵菌Mr006扩繁的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)莱氏绿僵菌Mr006孢子培养，获得孢子液；

(2)莱氏绿僵菌Mr006孢子扩繁，选择夜蛾科昆虫幼虫，用亚致死剂量氯虫苯甲酰胺酰胺处理，喷施孢子液，集中至无菌盒中，以人工饲料继续饲养至死亡或化蛹，观察虫体侵染情况，待第1次完全产孢后收集孢子，僵虫保湿后，继续扩繁培养再重复收取1-2次孢子，获得最大产孢量。

本发明的一个方案，本发明所述莱氏绿僵菌Mr006扩繁的方法步骤(1)中孢子培养的包括：配制莱氏绿僵菌Mr006产孢的培养基；培养基灭菌及接种；发酵培养获得孢子液；

本发明的一个方案，本发明所述莱氏绿僵菌Mr006扩繁的方法步骤(2)中所述夜蛾科昆虫为草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫；优选所述夜蛾科昆虫为斜纹夜蛾。