[发明专利]一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法和应用

权利要求书

1.一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将冷冻保存的微拟球藻进行解冻，随后用无菌生理盐水进行稀释后接种到已灭菌的培养基中，进行摇床振荡培养，得到活化微拟球藻；

（2）对活化微拟球藻进行超声辅助提取和酸提法对活化微拟球藻进行多糖提取，得到微拟球藻多糖粗提物；

（3）使用酶-溶剂萃取法，对微拟球藻多糖粗提物进行纯化，得到微拟球藻多糖；

（4）使用硫酸基团对微拟球藻多糖进行修饰，冷冻干燥后，得到硫酸化微拟球藻多糖；

（5）使用壳聚糖凝胶对硫酸化微拟球藻多糖进行负载，即得一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖。

2.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，其特征在于，冷冻保存的微拟球藻由以下步骤制得：

使用微型移液管将冷冻保护剂加入无菌去离子水中，得到冷冻保护液；

将微拟球藻使用无菌去离子水洗涤3次后，过滤后得到洗净的微拟球藻，随后加入冷冻保护液中，在黑暗和室温条件下混合30分钟，随后将体系置于4L氮蒸汽保温瓶中冷冻30分钟，随后浸入液氮罐中冷冻保存，即得冷冻保存的微拟球藻。

3.根据权利要求2所述的一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，其特征在于，所述冷冻保护剂为甲醇，冷冻保护液与微拟球藻的体积比为80：18。

4.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，其特征在于，活化微拟球藻由以下步骤制得:

将冷冻保存的微拟球藻置于7℃的血清水浴中，解冻90秒，随后将解冻后的微拟球藻接种在试管中，使用无菌去离子水将体系稀释至10倍体积，随后在室温下以3500rpm速率离心10分钟，过滤，使用F/2培养基对沉淀进行培养，光照强度4000Lux，光暗周期为12小时：12小时，取培养至稳定期，即得活化微拟球藻。

5.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，其特征在于，微拟球藻多糖粗提物由以下步骤制得：

A1、将活化微拟球藻在室温条件下以8000rpm速率离心10分钟，弃去上清液，使用蒸馏水洗涤3次后，以相同条件再次离心，将沉淀置于-80℃低温冷冻干燥2小时，随后研磨成粉末，过80目筛，得到微拟球藻粉末；

A2、将微拟球藻粉末加入去离子水中，搅拌均匀后进行超声提取，设置超声功率为100W，超声时间4秒，间隔时间4秒，超声处理20分钟，随后使用稀盐酸溶液调节体系pH值，并在恒温水浴条件下振荡提取，随后以3500rpm速率离心15分钟，取上清液在90℃恒温水浴的条件下浓缩至300mL，加入95%乙醇使得体系中乙醇浓度为30%，静置过夜后以3000rpm速率离心15分钟，取上清液再次加入95%乙醇，直至体系中乙醇浓度达到70%，以3500rpm速率离心15分钟后，留取沉淀，将沉淀冷冻干燥至恒重，即得到微拟球藻多糖粗提物。

6.根据权利要求5所述的一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，其特征在于，提取温度为60-80℃，提取pH值为2-4，提取时间为3-4小时，液料比为（20-30）：（1-2）。

7.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的微拟球藻多糖的制备方法，其特征在于，微拟球藻多糖由以下步骤制得：

B1、将蛋白水解酶加入无菌去离子水中，搅拌均匀，得到蛋白酶溶液；向其中加入微拟球藻多糖粗物，使用NaOH溶液调节体系pH值为8，在恒温水浴下反应2小时，得到酶解后的微拟球藻多糖粗提物；

B2、将氯仿与正丁醇溶液混合均匀，得到萃取溶剂；将酶解后的微拟球藻多糖粗提物与萃取溶剂振荡混合，振荡时间为25分钟，随后将体系置于3500rpm速率下离心15分钟，留取上清液，真空冷冻干燥，即得微拟球藻多糖。