[发明专利]一种梨多酚氧化酶PpyPPO4基因

说明书

本发明涉及一种梨多酚氧化酶PpyPPO4基因属于植物分子生物学和基因工程技术领域，提供了一种梨多酚氧化酶PpyPPO4基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。根据PpyPPO4基因全长序列设计VIGS引物，以高褐变品种‘威宁大黄梨’果实cDNA为模板，PCR扩增PpyPPO4基因的截断片段，截断片段核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；将截断片段与pTRV2‑VIGS载体相连，构建pTRV2‑PpyPPO4‑VIGS载体。通过VIGS瞬时转化技术可以显著降低易褐变品种‘威宁大黄梨’果实的PPO酶活及褐变。本发明构建的PpyPPO4基因VIGS载体可以显著抑制砂梨果实的酶促褐变，可利用基因工程基因干涉或敲除该基因，在水果低褐变或不褐变的分子育种中发挥重要作用。

技术领域

本发明涉及植物分子生物学和基因工程技术领域，具体是指一种梨多酚氧化酶PpyPPO4基因。

背景技术

果蔬在鲜食、贮运、包装或加工过程中受机械损伤后极易发生变色，这种现象被称为酶促褐变。据估计，超过50％热带和亚热带水果和蔬菜损失由酶促褐变造成。酶促褐变是指植物质体内储存的多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)在细胞损伤变成有氧条件下，催化液泡内酚类底物产生醌并形成褐色聚合物的过程。

梨(Pyrus spp.)是我国第三大栽培水果，酶促褐变也发生在梨鲜食、运输、包装、贮藏、加工等生产各环节，严重影响梨果外观品质和内在品质，大大降低其商品价值。低褐变种质创新和酶促褐变抑制技术研发是解决梨酶促褐变问题的关键，研究梨酶促褐变调控机理是重要的基础和前提。目前，国内外梨酶促褐变研究主要集中在生理机制方面，在其调控机制方面尚缺乏深入研究。酶促褐变多由高含量多酚和高水平PPO酶活引起，介于酚类物质在植物的抗病、抗虫、抗逆起到重要的作用，抑制PPO基因表达或活性是解决酶促褐变问题最直接有效的方法。

PPO是一类核基因编码酶，受多个基因控制，主要存在质体类囊体腔中，在植物中主要指儿茶酚氧化酶。PPO基因多基因家族性决定PPO的功能和活性各有差异。比如马铃薯9个不同PPO基因对褐变相关PPO活性的贡献不一样，其中一个PPO基因贡献率达到55％，说明影响酶促褐变的PPO基因虽然是多基因控制的但是存在关键的一个或几个PPO基因，通过CRISPR/Cas9技术将StPPO2基因突变后可显著降低PPO活性和酶促褐变。

前人通过生物信息学分析在GDR数据库的西洋梨中发现8个PPO基因序列。如专利申请号为CN200510019062.8的莲多酚氧化酶的基因序列及用途公开了莲幼叶cDNA中PPO基因的7个克隆序列，长度在978bp－1057bp，编码326－352个氨基酸，而且7个核苷酸序列及其相对应的7个氨基酸序列之间都有明显的差异。与GenBank中其它物种的PPO进行比较，其核苷酸序列相似性至少达到79％，氨基酸序列相似性至少达到61％。该基因的成功克隆，通过反义抑制或超量表达等生物工程方法选择性调节特定的莲器官、组织中PPO表达，抑制了莲藕的酶促褐变，增加了莲的抗虫抗病性。然而，目前关于梨中多酚氧化酶基因的功能分析鲜有报道，梨PPO家族的哪些成员在梨果实酶促褐变过程中发挥作用也不明确。因此，挖掘和利用PPO基因，明晰PPO基因在梨果实酶促褐变中的功能，对梨低褐变基因资源挖掘和酶促褐变控制技术研发具有重要的理论意义和应用价值。

发明内容

本发明要解决上述技术问题，提供针对梨低褐变基因资源挖掘和利用不足的的现状，本发明的目的是提供梨PpyPPO4基因及其应用，能够通过调控它们基因表达达到调控梨果实酶促褐变的效果。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：

一种梨多酚氧化酶PpyPPO4基因，所述的基因的全长核酸序列如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，并包含1764bp的开放阅读框和编码587个氨基酸。

优选地，所述的编码587个氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示的截断片段核苷酸序列。