[发明专利]一种测定mRNA 3’Poly(A)尾长度及其分布的方法

说明书

本发明公开一种测定mRNA 3’Poly(A)尾长度及其分布的方法。该方法包括以下步骤：(1)mRNA变性；(2)使变性后的mRNA与内切核糖核酸酶在适于酶切的条件下孵育；(3)确定mRNA 3’Poly(A)尾长度及其分布。本发明解决了通过RNase T1切割后较为繁琐的实验步骤。此外，通过mRNA样品前处理中改变消化酶及简化实验流程等方面进行了优化，从而进一步提高了检测方法的可靠性，同时核糖核酸内切酶切割位点的目标物响应度明显提高，且实验周期明显缩短。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种测定mRNA 3’Poly(A)尾长度及其分布的方法。

背景技术

作为一种治疗性或预防性的药物产品，mRNA药物必须依照法规要求进行深入的分析表征。国家药监局发布的《新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则》，提到对于mRNA体外合成需要进行过程和产物的控制检测，包括加帽率、加Poly(A)尾长度等。2022年2月23日美国药典(USP)制定新的“mRNA疫苗质量分析方法”指南草案，支持mRNA疫苗和疗法的质量评估。2022年5月31日国家药监局药审中心(CDE)也发布了“体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则(试行)”用于强化mRNA药品的质量标准。

由于5’端帽子结构和3’ Poly(A)尾结构在mRNA的翻译及稳定性中起着重要的调节作用，因此测定mRNA的加帽效率及3’ Poly(A)尾长度和分布是评价mRNA质量的重要指标。

3’端Poly(A)尾巴对于mRNA的翻译来说发挥着至关重要的作用，它可以保护mRNA不被降解，增加mRNA的稳定性，提高翻译效率。因此，有效地检测核酸尾部Poly A的长度及不同长度A的占比是评估mRNA质量的重要指标。

目前常用的Poly(A)尾检测方法有变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、毛细管电泳（CE）、液相色谱（HPLC）以及液相色谱质谱联用（LC-MS）等。另外，基于二代或三代测序技术，也可以用于表征Poly(A)，已报道的测序方法包括TAIL-seq、PAL-seq、FLAM-Seq、PAIso-Seq和纳米孔RNA直接测序平台等，都能够较准确地给出Poly(A)尾巴长度信息。

对于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用工具酶酶切后并纯化回收3’端PolyA尾，随后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对经过处理后PolyA尾的样品进行定性分析。该方法对于样本量没有太高要求，但是在实际应用中容易受到片段大小、凝胶分辨率等许多因素的影响，导致灵敏度不佳，通常用于早期定性研究。

HPLC方法是将不同样本流出物的组成和含量变化转变为电信号，通过电子仪器测定，从而实现定性定量，来表征mRNA的产品纯度和完整性。但其分辨率很难将含不同PolyA尾结构的mRNA区分开来，样本量要求很高并且针对不同序列需要重新建立方法，较为繁琐，因此通常不单一使用来对mRNA 3’端PolyA尾进行检测。不过HPLC无法对mRNA 3’端PolyA尾（多数mRNA的PolyA长度为50-200nt）分子量进行准确测定，且不同长度3’端PolyA尾相邻长度分子量差距329.2Da，呈现为正态分布或者类正态分布，难以实现有效分离。

对于基于测序平台的PolyA尾检测，基于Illumina平台的TAIL-Seq和PAL-Seq技术，以及第三代测序技术PacBio平台，通过构建cDNA文库对PolyA尾或全长mRNA进行测序，可检测PolyA尾长度和序列完整性。但二者均依赖于PCR扩增cDNA，长均聚物的存在导致PCR扩增不可避免地存在偏差，可能对PolyA尾长和序列准确性造成影响。OxfordNanoporeTechnologies（ONT）开发的纳米孔RNA直接测序技术分析PolyA尾方法，不依赖于逆转录与PCR扩增，可以实现PolyA尾部长度及序列准确性的检测，不存在PCR偏倚性。然而以TAILseq、PALseq、FLAMseq、PATseq及纳米孔测序为代表的测序技术通量大、设备要求高，鉴于体外合成的mRNA通量较小，无法体现测序技术的高通量优势。