[发明专利]一种沙门氏菌活菌可视化检测方法

权利要求书

1.一种沙门氏菌活菌可视化检测方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）从样品中提取总RNA，并将提取的RNA加入RCA反应体系中进行扩增，RCA包括连接反应和扩增反应，反应体系中包含待测RNA、5’端磷酸化锁式探针（padlock）、T4 DNA连接酶缓冲液、T4 DNA连接酶、扩增引物（primer）、dNTP、phi29 DNA聚合酶缓冲液、phi29 DNA聚合酶和水；（2）向RCA反应产物中加入嵌入DNA双链荧光染料DiYO-1，在荧光显微镜下对荧光点进行计数，将沙门氏菌的浓度转换为荧光亮点的个数，从而实现定量检测。

2.根据权利要求1所述的沙门氏菌活菌可视化检测方法，其特征在于，在于以RNA为靶标，从而实现活菌检测。

3.根据权利要求1所述的沙门氏菌活菌可视化检测方法，其特征在于，通过荧光显微镜对RCA扩增产物进行可视化成像计数，一个荧光点代表一个RNA分子，进而高灵敏度、宽线性范围地量化活菌。

4.根据权利要求1所述的沙门氏菌活菌可视化检测方法，其特征在于，RCA反应体系中5’端磷酸化的padlock序列如SEQ ID NO.5~8所示。

5.根据权利要求1所述的沙门氏菌活菌可视化检测方法，其特征在于，RCA反应体系中primer序列如SEQ ID NO.9所示。

6.根据权利要求1所述的沙门氏菌活菌可视化检测方法，其特征在于，RCA连接反应在室温（25 ℃）下进行1~2 h，包含0.5~2 μM磷酸化的padlock，靶标RNA，T4 DNA连接酶缓冲液，0.05~1 U/μL T4 DNA连接酶和水。

7.根据权利要求1所述的沙门氏菌活菌可视化检测方法，其特征在于，RCA扩增在30 ℃下反应0.5~1.5 h，总体积为40 μL，包含连接反应液，0.5~2 μM primer，0.5~2 mM dNTP，phi29 DNA聚合酶缓冲液，0.1~0.5 U/μL phi29 DNA聚合酶。

8.根据权利要求1所述的沙门氏菌活菌可视化检测方法，其特征在于，可实现巴氏杀菌后沙门氏菌活菌的可视化检测。