[发明专利]一种沙门氏菌活菌可视化检测方法

说明书

本发明公开了一种沙门氏菌活菌可视化检测方法，属于核酸检测领域。本发明以沙门氏菌RNA为靶标，通过滚环扩增（RCA）实现了在恒温条件下对靶标的信号放大，并通过荧光成像直接计数扩增产物，实现了对沙门氏菌活菌的高灵敏、宽线性范围的可视化检测。本发明所构建的方法能够在10supgt;1/supgt;‑10supgt;7/supgt; CFU/mL的范围内对沙门氏菌活菌进行定量，线性范围广，其检出限为10 CFU/mL。该方法能够在活/死菌混合体系内，检测低至0.1%的沙门氏菌活菌。本发明应用于巴氏杀菌法的杀菌效果评估，与标准培养法相比，回收率在85.84%‑116.51%之间，为食品微生物控制方法提供了一种新的筛选和评估工具。

技术领域

本发明属于核酸检测领域，尤其涉及一种沙门氏菌活菌可视化检测方法。

背景技术

食源性致病菌在食品工业中普遍存在，是引起食源性中毒和感染性疾病的主要原因，而随着经济全球化、人口快速流动和国际贸易，食品污染和由此引发疾病的风险越来越大。作为最常见的食源性致病菌之一，沙门氏菌导致了全球各地的大量食物中毒、疾病和死亡，在食品安全领域引起了极大的关注。在过去的十年里，几乎所有类型的食物来源，如蔬菜、肉类、谷类和水果，都是沙门氏菌相关食源性暴发的携带者。根据疾病控制和预防中心公布的统计数据，在美国每年由沙门氏菌引起的感染约有120万例，引起的死亡约450例，而在发展中国家，沙门氏菌感染情况更为严重。食源性沙门氏菌的检测不仅对人类健康有重大影响，对沙门氏菌污染控制相关的费用也有很大影响。因此，沙门氏菌的快速检测对食品工业和安全分析来说是一个相当大的挑战。在沙门氏菌污染的筛查中，活菌是感染的真正原因。然而，快速、灵敏和可靠地检测活的病原菌的工具仍然缺乏。

目前检测致病菌的方法主要有培养法、免疫测定法和核酸测定法。培养法能可靠地检测活细菌，但劳动强度高，样品到结果的周转时间长。免疫分析使用抗体直接识别细菌，然后进行酶扩增，从而实现对病原菌的快速和特异检测，但它们不能区分活细菌和非活细菌。而基于核酸的方法大部分是为检测DNA而设计的。然而，无论微生物细胞的生理学如何，DNA靶向的方法都很难检测到细菌活性，因为DNA可以长期存在。相比之下，由于RNA的磷酸二酯键不如DNA稳定，它比DNA更容易降解。在细胞死亡后，由于细胞内和细胞外有害因子的释放，RNA水平迅速下降。因此，与基于DNA的方法不同，基于RNA的检测可以被认为是样品中活细菌独有的，RNA的存在可以表明活细菌的存在。而且由于食源性致病菌通常以低浓度存在于食品样品中，因此需要新型的快速检测方法来实现对低浓度活菌的准确可靠检测。

RCA在等温条件下以线性或几何动力复制环状寡核苷酸探针，可生成长的ssDNA低聚物，由与环状DNA引物序列互补的串联重复序列组成。由于扩增产物分子量大，以至于可以聚集在表面上并作为单个分子被检测出来。与PCR不同，最终的ssDNA产物仍然附着在初始RCA引物结合域上。因此，RCA提供了一种工具，用于将单个DNA拷贝转换为1 μm大小的荧光点可计数的产物，非常适合用荧光显微镜进行定量。RCA扩增过程最近已用于各种检测，以实现增强的靶标检测，而通过RCA扩增成像的方式检测细菌核酸，能够很大程度提高检测的线性范围，例如Jonas Jarvius等利用RCA构建的放大单分子检测方法允许在七个数量级的动态范围内对分子进行多重检测和高精度定量。

目前未见RCA扩增产物成像计数用于检测食源性沙门氏菌活菌。在本发明中，我们构建了一种沙门氏菌活菌可视化检测方法，通过锁式探针对沙门氏菌RNA进行识别，引发RCA扩增，添加高特异性核酸染料后通过荧光显微镜成像进行扩增产物的可视化，实现对沙门氏菌RNA分子的数字量化。本方法摆脱了对热循环设施的依赖，克服了现有检测方法难以定量低浓度活菌的不足，具有良好的应用前景。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供一种沙门氏菌活菌可视化检测方法，将分子计数与RCA扩增有机结合，可以实现沙门氏菌RNA的高灵敏度、宽线性范围的检测，能够特异性区分沙门氏菌活菌。

本发明所述的沙门氏菌活菌可视化检测方法具体包括如下检测步骤：